禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

陈晓春，赵 炜，苏 佳，王 嘉，侯力丹，黄小洁，吴华伟，李俊平

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis，RE)是指由反转录病毒科网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)群引起的几种禽类的一群病理综合征，主要包括矮小综合征、淋巴组织及其他组织形成的慢性肿瘤、急性网状细胞肿瘤等[1]，能引起严重的免疫抑制。该病在禽群中普遍存在，而且一旦种禽感染，可通过垂直传播迅速波及整个群体。疫苗中污染REV被认为是近些年引起RE传播和流行的主要途径，报道最多的是被REV污染的禽痘疫苗和马立克氏病疫苗使用后引起的严重经济损失[2-3]，其次是禽成髓细胞性白血病病毒作为反转录酶的来源而广泛用于生化研究，其种毒含有低水平的REV[4]。2004年，丁家波等利用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay, IFA)、PCR和核酸杂交等方法，对国内多家企业生产的禽痘病毒疫苗和禽痘病毒(Fowl pox virus, FPV)临床分离株进行了REV污染和基因整合情况研究，发现所有疫苗样品的FPV基因组和临床分离株中均检出REV核酸阳性或病毒阳性，这是我国首次关于FPV基因组中整合进REV基因组成分的报道[5]。2005-2009年，李俊平等对203批次禽用活疫苗采用IFA法进行REV污染检测，结果检出鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗和鸡痘活疫苗(鹌鹑化弱毒)2个品种共8个批次呈阳性(3.9%)[4]。

目前，我国已强制要求兽用活疫苗生产必须使用SPF鸡胚，彻底杜绝用非免疫鸡胚制备活疫苗，在一定程度上保证了禽用疫苗的质量和养禽业的健康发展。《欧洲药典》和《英国药典(兽药)》只对生产禽源疫苗的种毒和生产原材料(主要是SPF鸡胚)进行REV污染的检测，对成品中是否污染REV没有要求检测。《日本农林水产省兽医生物制品标准》要求对成品进行REV污染检测。我国从2010年版《中国兽药典》开始将REV和禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的检测列入禽外源病毒检测必检项目[3]。REV检测采用IFA方法进行，使用的一抗为SPF鸡制备的多克隆抗体，染色效果良好。但制备多克隆抗体过程繁琐、周期长、成本高，而且多克隆抗体本身的特异性也有待提高。为降低制备成本，进一步提高检验的特异性，本研究制备了针对REV主要囊膜蛋白gp90的单克隆抗体，并建立了基于单抗的IFA方法，用于外源性REV检验。

1 材 料

1.1 细胞与动物 SP2/0骨髓瘤细胞、BALB/c小鼠等单克隆抗体制备用材料均由北京六合华大蛋白研发中心有限公司提供。鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast, CEF)按照现行《中国兽药典》附录进行制备。

1.2 病毒

1.2.1 REV REV-T株由中国兽医药品监察所保存；CY 1111株(2011年，山东，蛋鸡)[6]、SY 1209株(2012年，辽宁，蛋鸡)[6]、HS/1412 R株(2014年，辽宁，蛋鸡)[7]、HLJR 0901株(2009年，黑龙江，蛋鸡)[8]，均由哈尔滨兽医研究所提供；HA 1101株(2011，江苏，蛋鸡)[9]，由扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室提供；IBD-C 1605株(2015，山东，REV污染疫苗)[10]、REV 161214株(2016，河北，蛋鸡)、SDAUS-1株(2016，河北，公鸡精液)，由山东农业大学家禽肿瘤病实验室提供。

1.2.2 ALV ALV-A(RAV-1株)、ALV-B(RAV-2株)由中国兽医药品监察所保存；ALV-C(RAV-49)、ALV-J(HPRS-103)由哈尔滨兽医研究所提供；ALV-K(SDAUAK 11株)[11]由山东农业大学家禽肿瘤病实验室提供。

1.2.3 其他病毒 鸡新城疫病毒(NDV)La Sota株、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)B87株、火鸡疱疹病毒(HVT)Fc126株、鸡马立克氏病毒活疫苗(MDV)CVI 988株、禽腺病毒I群(FAdV-I)YR36株,均由中国兽医药品监察所保存。

1.3 菌种、载体 表达载体pET-30a、表达菌BL21及蛋白表达与纯化试剂均由北京六合华大蛋白研发中心有限公司提供。

1.4 其他试剂 FITC标记的抗小鼠IgG，sigma公司产品；新生牛血清，Hyclone公司产品；M199细胞培养液，Gibco公司产品。

2 方 法

2.1 免疫原的制备 根据GenBank上公布的REV序列，采用DNAStar软件对SU蛋白进行二级结构、亲疏水性、抗原性和功能区的分析，选取抗原表位相对集中的53～362 aa蛋白序列作为目的片段。对该区域的核苷酸片段(1098 bp)进行合成，并在5′和3′端加入EcoRⅠ和XhoI酶切位点，用于载体的克隆。序列合成在北京六合华大蛋白研发中心有限公司进行。

用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoI分别对合成的序列和质粒pET-30a进行双酶切，将纯化回收的片段和表达载体酶切产物用DNA Ligation Kit连接后转化至感受态细胞(BL21)。挑取单克隆菌株培养，经PCR鉴定后，用IPTG(0.5 mmol/L)16 ℃诱导过夜，离心收获菌体，超声破菌(500 W，180次，每次5 s，间隔5 s)。通过镍柱纯化，经SDS-PAGE电泳检测纯度在85 %以上时，作为单抗的免疫原。

2.2 单克隆抗体的制备与鉴定 用上述纯化蛋白按每只小鼠30 μg～60 μg的剂量，多次皮下注射4只BALB/c雌性小鼠。采用间接ELISA检测小鼠抗体效价，对血清效价较高的小鼠，用免疫原50 μg进行腹腔注射免疫冲击一次，免疫后3日，按常规方法进行细胞融合。将上述融合细胞培养物经SU蛋白包被的ELISA板进行两次筛选，挑选ELISA阳性的杂交瘤细胞株上清采用IFA方法筛选与REV全病毒具有良好反应性的细胞株。然后选取免疫荧光检测为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，直至细胞克隆抗体阳性率达100 %，扩大培养后液氮中保存。对筛选出的杂交瘤细胞株分别进行亚型鉴定、细胞稳定性检测、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验。

2.3 腹水的制备 经鉴定合格后，制备小鼠腹水。取9周龄BALB/c小鼠10只，腹腔注射降植烷，每只0.5 mL。7～10 d后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1×106～1×107/0.5mL，7～10 d后观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大、行动不便时，抽取小鼠腹水，3000 r/min离心10 min，取上清，-40 ℃保存。间隔2～3 d，若腹水再次产生，可再次采集。

2.4 效价测定 将REV-T株病毒液用含2%新生牛血清的M199培养液稀释成100 TCID50/0.1mL，接种已长成良好CEF单层的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的温箱中培养5 d，冷甲醇固定。将腹水进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400稀释，测定效价。

2.5 特异性试验 对接种了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)等病原(毒株信息见1.2项)的带毒细胞进行检测，观察是否出现特异性荧光，以确定该单抗的特异性。

2.6 单抗反应性协作标定 委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、山东农业大学家禽肿瘤病实验室、扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室对该单抗进行不同REV毒株反应性和不同亚型ALV毒株反应性验证试验。毒株信息见1.2项。

2.7 IFA方法的建立

2.7.1 IFA试验程序

2.7.1.1 病毒感染细胞板的制备 将阳性病毒用含2%新生牛血清的M199培养液稀释成100 TCID50/0.1mL，接种已长成良好CEF单层的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的温箱中培养5 d，进行间接免疫荧光染色。

2.7.1.2 固定 采用冷甲醇固定细胞板，自然晾干，2～8 ℃保存备用。

2.7.1.3 加一抗(单克隆抗体) 将待检的单克隆抗体用PBS稀释适宜倍数，加入REV感染细胞板中，37 ℃孵育。

2.7.1.4 洗涤 弃去板孔中的一抗，用PBS洗涤并轻微振荡洗涤。

2.7.1.5 荧光二抗染色 尽量弃尽洗液，每孔加入用PBS作适当稀释的荧光标记的羊抗小鼠IgG，37 ℃避光孵育。

2.7.1.6 洗涤 方法同2.7.1.4项。

2.7.1.7 观察 在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光(波长490 nm)观察。被感染的CEF细胞呈现绿色荧光，有完整的细胞形态，周围未感染细胞不着色，视野发暗。

2.7.1.8 结果判定 正常细胞对照背景最暗且无特异性荧光。根据荧光强弱，其结果可判为-(无特异性荧光，背景纯净)、+(1个视野内有1个左右的特异性荧光)、++(1个视野内有1～10个特异性荧光)、+++(1个视野内有10个以上特异性荧光)。

利用小型榨油机榨取油脂，其出油率在21.1%～24.6%，其中三层模式的出油率平均最高，达到23.5%，此时毛叶山桐子油料最终含水量在8%，这与其他油料作物（如油菜）安全水分相近[12]。榨取的毛油酸价和过氧化值分别在 3.1～3.4 mg/g，2.1～2.9 mmol/kg，并且各处理各干燥层数值无显著差异（p＞0.05），均低于国家对菜籽、油茶籽等毛油的品质标准规定，优于崔艳南等人[13]研究的未处理的工厂化毛叶山桐子毛油品质，这与干燥前处理与设备均有关系。

2.7.2 IFA试验最适工作条件的确定

2.7.2.1 一抗工作浓度的确定 按照2.7.1项程序，以REV单克隆抗体作为一抗，工作浓度设1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀释度，以呈现“+++”荧光强度的最大稀释倍数作为一抗的最适工作浓度。

2.7.2.2 二抗工作浓度的确定 以上述确定的反应条件，将二抗分别作1∶100、1∶200、1∶400稀释，进行IFA反应，以呈现“+++”荧光强度的最大稀释倍数作为二抗的最适工作浓度。

2.7.2.3 一抗作用时间的确定 以上述确定的反应条件，分别以30 min、45 min、60 min作为一抗作用时间，进行IFA反应，观察比较一抗作用时间对试验结果的影响，确定一抗最适作用时间。

2.7.2.4 二抗作用时间的确定 以上述确定的反应条件，分别以30 min、45 min、60 min作为二抗作用时间，进行IFA反应，观察比较二抗作用时间对试验结果的影响，确定二抗最适作用时间。

2.8 人工感染试验 取鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)、鸡新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和鸡马立克氏病活疫苗(CVI 988株)三种疫苗各1批，样品处理前每500羽份分别加入含50 TCID50、10 TCID50、5 TCID50、1 TCID50的REV-T株阳性病毒，同时设定未添加REV的疫苗对照组，按照《中国兽药典》2015年版三部附录3304进行样品处理、接种和传代培养，采用上述建立的IFA方法进行荧光染色，确定该方法最小检出限。同时采用REV多克隆抗体进行比较和验证。

3 结果与分析

3.1 重组SU蛋白的表达 重组菌经诱导表达后，超声破菌，离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。结果在沉淀中检测到大量的目的蛋白，说明该重组蛋白表达形式为包涵体表达(图1)。

M：Marker；1：超声后上清； 2：超声后沉淀M：Marker; 1：Supernatant after ultrasound； 2：Precipitation after ultrasound图1 REV-SU蛋白可溶性分析Fig 1 Solubility analysis of REV-SU protein

3.2 重组SU蛋白的纯化与鉴定 纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，以BSA为标准，通过SDS-PAGE凝胶扫描分析估计蛋白浓度为0.5 mg/mL，纯度为85%。SDS-PAGE结果显示在约46 kD处有明显蛋白条带(图2)。

M：Marker；1：蛋白原样；2：流穿；3： 15 mmol/L 咪唑洗脱；4： 60 mmol/L咪唑洗脱；5： 500 mmol/L 咪唑洗脱；6： 0.5 mg/mL BSAM：Marker; 1：Original protein; 2：Flow through; 3：Eluted by 15 mmol/L imidazole; 4：Eluted by 60 mmol/L imidazole; 5：Eluted by 500 mmol/L imidazole; 6： 0.5 mg/mL BSA图2 REV-SU蛋白纯化SDS-PAGE图Fig 2 SDS-PAGE of purified REV-SU protein

3.3 杂交瘤细胞的筛选 采用REV-T株对ELISA阳性的杂交瘤细胞进行IFA筛选，结果筛选出1株与病毒产生特异性荧光的杂交瘤细胞，命名为Mab-SU-2A2株。结果见图3。

3.4 杂交瘤细胞的鉴定结果 纯净性检验结果表明，杂交瘤细胞株Mab-SU-2A2株无菌生长，无支原体生长，无外源病毒污染，纯净性良好；该细胞株亚型为IgG2a亚型；连续培养10代，培养上清IFA效价均在1∶10～1∶20，稳定性好。

3.5 腹水效价测定 大量制备小鼠腹水，用IFA方法测定抗体效价，结果表明，Mab-SU-2A2株单抗腹水稀释至1∶51200时，细胞仍可见特异性绿色荧光(图4)，IFA效价为1∶51200。

图4 单抗2A2腹水效价测定结果Fig 4 Determination of IFA titer of Mab 2A2 ascites

3.6 特异性试验 对接种了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)病原的带毒细胞进行REV单抗荧光染色，均未检测到特异性荧光，说明该单抗特异性良好。

3.7 协作标定结果 三家实验室协作标定结果显示，Mab-SU-2A2株单克隆抗体对于不同的REV毒株具有良好的反应性，分离株分别分离自山东、辽宁、黑龙江、吉林、河北等地，分离年份从2011年至2016年，样品来源包括蛋鸡、公鸡精液及受污染的IBDV疫苗(图5)；与分离自不同年份的A、B、C、J、K等亚群的ALV毒株均无交叉反应(图6)，特异性良好。

图5 单抗2A2与不同REV毒株反应性结果Fig 5 Reaction between Mab-Su-2A2 with different REV strains

图6 单抗2A2与不同ALV毒株反应性结果Fig 6 Reaction between Mab-Su-2A2 with different ALV strains

3.8 IFA方法条件优化 经优化，确定IFA最适反应条件为：一抗1∶800稀释，作用时间60 min；二抗1∶200稀释，作用时间60 min。

3.9 人工感染试验 结果表明，采用REV单克隆抗体作为一抗对污染了不同剂量REV的鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)、鸡新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和鸡马立克氏病活疫苗(CVI 988株)三种疫苗进行检测的最低检出量分别为5 TCID50、5 TCID50、10 TCID50，与鸡抗REV多克隆抗体作为一抗进行荧光染色结果相当(分别为5 TCID50、10 TCID50、10 TCID50)，且背景更加纯净(图7)。

A：10 TCID50污染组REV单抗染色；B：疫苗对照组REV单抗染色；C：10 TCID50污染组REV多克隆抗体染色；D：疫苗对照组REV多克隆抗体染色A：Stained with REV Mab in 10 TCID50 contaminated group; B：Stained with REV Mab in negative control; C：Stained with REV Pab in 10 TCID50 contaminated group; D：Stained with REV Pab in negative control图7 活疫苗中人工感染REV的IFA检测Fig 7 IFA detection of artificial-infected REV in live vaccine

4 讨论与结论

REV感染可引起鸡群生产性能下降和免疫功能低下，一旦疫苗污染REV，可对养殖业造成巨大经济损失[1]。因此对禽用活疫苗进行REV污染检测是确保疫苗产品质量和严格控制REV的重要手段。《中国兽药典》2010年版三部收录了外源性REV检验方法[12],该方法的颁布实施对禽用生物制品的质量控制起到了至关重要的作用。2021年，李雪莲随机抽取4种市售活疫苗，利用RT-PCR法、《中国兽药典》IFA检测法和SPF鸡检查法检测活疫苗中的REV污染，比较三种检测方法的优劣。结果表明，RT-PCR法方便、快捷，但会出现假阳性；SPF鸡检查法结果可靠，但周期较长，成本高；IFA检测法与传统鸡检查法相比具有快速、准确、成本低的优点，便于临床推广应用[13]。《中国兽药典》2010年版和2015年版中该方法采用REV多克隆抗体作为荧光染色的一抗，在实施过程中发现，受细胞状态、接种样品品种等因素的影响，偶尔会出现检测背景不清的现象。

gp90蛋白是一种膜表面糖蛋白，在不同时期和地域的REV分离株基因组中其氨基酸同源性超过95%[14]，保守性好，常被作为REV检测和禽病毒性淋巴瘤(MDV和ALV)鉴别诊断的一个重要靶标蛋白[15-16]。因此本研究将REV囊膜蛋白gp90(SU)作为免疫原制备了单克隆抗体。该单抗与不同REV毒株均具有良好的反应性，且与不同ALV毒株和常见禽源病毒均没有交叉反应，特异性良好。采用该单克隆抗体建立的IFA方法可检出至少5 TCID50的REV感染，与多克隆抗体作为检测一抗具有同等效力，且检测背景更加纯净清晰。该成果已被《中国兽药典》2020年版三部收录[17]，用于禽用生物制品及原材料中外源性REV的检测，为有效控制我国禽用活疫苗质量、完善国家标准和动物疫病防控提供了技术支持。

致谢：感谢哈尔滨兽医研究所高玉龙研究员、扬州大学钱琨博士、山东农业大学赵鹏教授对本文给予的大力支持和帮助！