基于网络药理学探讨苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻的作用机制

马 力，宋延平，杨彦平，赵林涛，郭 倩

(1. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，西安 7100033;西安雨田农业科技股份有限公司，西安 710065)

仔猪细菌性腹泻是由于感染大肠杆菌等细菌以及饲养管理不当造成的一种高发的肠道疾病，好发于10～30日龄仔猪，致死率高[1]。中兽医认为仔猪细菌性腹泻多因机体正气不足，寒湿暑热等外邪趁机入侵、饮食不洁、饲养过饱等，导致脾胃腐熟、运化失调、清浊不分,毒邪滞留肠中,使肠道气滞血瘀,化为脓血,故下痢色白或带脓血；严重者会导致中气下陷,出现脱肛等现象,严重者亡阳虚脱致死；中医治则多采用涩肠止泻、清热燥湿的方剂治疗该病,必要时以扶正固本的中药为辅[2]。已有文献报道，应用我国传统中医药治疗细菌性仔猪腹泻有良好的效果[3-5]。

苦白石颗粒由苦参、白头翁、石榴皮、仙鹤草、肉桂、木香等中药制成,方中苦参、白头翁清热燥湿、凉血止痢[6,7]；仙鹤草、石榴皮可收敛止血止痢、涩肠止泻[8,9];肉桂[10]补元阳、暖脾胃,治命门火衰、亡阳虚脱、腹痛泄泻;木香[11]主治行气止痛、健脾消食,诸药合用,具有清热燥湿、涩肠止泻、扶阳固本、健胃消食的作用,可治疗仔猪湿热下痢,且临床试验表明疗效可靠,安全性实验结果显示对仔猪无毒副作用,是临床值得推广的中兽药方剂[12-14]。但是目前苦白石颗粒作用于仔猪腹泻的机制和通路研究较少，无法体现中药通过多成分、多靶点、多通路共同作用的特点。

网络药理学以系统生物学为基础，结合多向药理学、分子网络数据以及计算机模拟分析等技术，通过构建药物—成分—靶点之间的复杂网络关系来阐明药物作用的方法。在这项研究中，首先通过生物利用度和药物相似度筛选获得苦白石颗粒的有效成分，预测了活性成分的潜在靶点并进行了相应的基因本体(GO)分析和京都基因组百科全书(KEGG)富集分析，对方中的关键活性成分和靶点蛋白进行了分子对接。利用网络药理学结合分子对接技术对潜在活性成分作用于靶点和通路的机制进行初步研究，这符合中医治疗疾病的整体观念，也为其深入研究和进一步新药开发提供参考。

1 材料和方法

网络药理学和分子对接的具体研究内容和方法见图1。

图1 研究内容和方法流程图Fig. 1 Flow chart of research contents and methods

1.1 筛选苦白石颗粒的活性成分 现代中药化学已对苦白石颗粒中6味中药进行了很多研究，发现其中含有的化合物，有些已被报道具有抑菌[8]、调节炎症因子[6]等显著的药理活性。这对利用网络药理学的方法来研究药物在中医药治理论指导下治疗疾病提供了良好的思路。

所有候选化合物中肉桂的活性成分来自于BATMAN数据库(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，并录入 TCMSP以匹配信息；其余5种中药均来自于TCMSP数据库(选择DL≥0.18和OB≥30%为筛选条件[15])，以及相关文献数据的整理。

1.2 药物靶点预测 预测药物靶点是解释中药进入体内生物作用过程的基础。TCSMP数据库通过已获取活性成分预测其潜在作用靶点。

1.3 仔猪细菌性腹泻差异表达基因的筛选 芯片数据(GSE28003)[16]从GEO数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下载，这个芯片数据是基于GPL3533 芯片平台。GSE28003包含了18例样品标本，其中12例经产肠毒素大肠杆菌(ETEC)GIS26菌株处理，6例作为正常对照，采用GEO2R在线工具筛选由于ETEC感染的腹泻仔猪和正常仔猪样本的差异表达基因(differential expression genes(DEGs),设置阈值为：|log2FC|>0.5，校正P<0.05。FC(fold change)代表两组基因表达值间的差异倍数。

1.4 蛋白质互作网络构建及核心靶点筛选 药物预测靶点和疾病靶点映射后得到交集靶点，导入String(https:∥string-db.org/cgi/input.pl)将蛋白质互作关系网络数据保存为“.tsv”文件，通过Cytoscape3.7.2[17]进行可视化，并利用其内置network analyzer 分析工具分析网络特征参数，包括连接度中心性(Degree centrality，DC)、紧密度中心性(Closeness centrality，CC)、介度中心性(Betweenness centrality，BC)等。

1.5 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图

构建 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络主要通过软件Cytoscape3.7.2来完成，其中节点代表药物、活性成分、靶点或疾病，边代表它们之间的相互关系；同时利用network analyzer计算各个节点的重要属性值，以研究其中较为重要的成分和靶点之间的关系。

1.6 富集分析 基因本体论(GO)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)分析获得的生物过程和信号相关通路相关也是研究药物作用于人体的关键。Metascape平台(http:∥metascape.org)[18]可对靶点进行通路富集分析，该平台更新及时，整合了GO、KEGG、Uniprot 等多个权威的功能数据库，支持对批量基因或蛋白质进行注释、富集分析及构建PPI 网络，GO富集分析可分为细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)三个部分。将潜在作用靶点导入Metascape 平台进行GO 及KEGG 分析，保存其结果并对其进行可视化。

1.7 分子对接 从Protein Data Bank (PDB, http:∥www.rcsb.org)[19]下载关键蛋白结构，从ZINC database (http:∥zinc.docking.org/)[20]中找到主要活性成组分的三维结构。将改造后的蛋白和组分引入AutoDock Vina进行分子对接，在相同条件下进行分子对接模拟，两者结合能越低，构象越稳定，发生作用可能性越大，一般以结合能绝对值大于 4.25 说明具有结合活性，大于 5.0 表明有较好的结合活性，大于 7.0 说明具有强烈的结合活性[15]；选择构象最高、结合自由能绝对值最大的对接结果,并应用 Pymol软件将对接结果可视化。

2 结果与分析

2.1 苦白石颗粒的活性成分 在TCSMP数据库中通过各组分的ADME性质来筛选潜在的活性成分，结果得到了74个OB≥30%、DL≥0.18的潜在活性分子(苦参45个，白头翁11个，石榴皮7个，仙鹤草5个，木香6个)；通过BATMAN数据库(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，共得到了肉桂19个活性成分。最后，共有93个化合物被认为是苦白石颗粒潜在的活性化合物。

2.2 获取活性成分的潜在靶点 通过TCSMP数据库对93种潜在活性化合物的靶点进行了预测，共收集到269个靶点。其中，苦参45种潜在有效成分共同作用于203个靶点; 白头翁11种潜在有效成分共同作用于83个靶点; 石榴皮7种潜在有效成分共同作用于197个靶点; 仙鹤草5种潜在有效成分共同作用于182个靶点; 肉桂19种潜在有效成分共同作用于77个靶点;木香6种潜在活性成分共同作用于32个靶点。因此，不同的活性化合物可以作用于同一靶点，同一活性化合物也可以作用于不同的靶点，体现了中药复方多组分、多靶点的作用特点。

2.3 苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻的靶点基因

GEO基因数据库筛选仔猪细菌性腹泻差异表达基因，再根据文献报道补充未预测到的有效成分的已知靶点，并利用Uniprot 数据库将所得靶点标准化，共得到疾病靶点479个，其中上调基因270个，下调基因209个。与2.2获取的潜在靶点相映射，得到苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻的靶点32个，如图2。

图2 交集靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of intersection target

2.4 蛋白互作网络的构建与分析 将获得的32个交集靶点基因导入 String 数据库，限定物种为“Sus scrofa”，将获得的数据导入Cytoscape 3.7.2 软件构建靶点蛋白相互作用网络图(隐藏掉没有交集的靶点)。结果显示，该网络共涉及 25个节点、106条边，如图3所示节点颜色越深，形状越大，说明其在网络中越重要。不难发现TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶点与其他靶点相互作用较强，药物作用于机体时这些靶点发挥重要作用。

String的PPI图 Cytoscape的PPI图图3 蛋白相互作用网络图Fig. 3 Protein-protein interaction network

2.5 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络构建与分析 靶点与其对应的潜在活性成分导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建了苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻的“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图。其中绿色三角代表药物，Piglet diarrhoea代表疾病，主要的活性成分用蓝紫色的圆形表示，黄色的四边形代表靶点(图4)。对化学成分进行度值计算，发现度值较高的槲皮素、木犀草素、山奈酚等潜在活性成分可能是防控仔猪细菌性腹泻的关键成分。

String的PPI图 Cytoscape的PPI图图4 药物-活性成分-靶点-疾病网络图Fig. 4 Drug - active ingredient - target - disease network

2.6 苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻通路富集结果分析及可视化

2.6.1 GO富集分析 对核心靶点分别进行GO-CC、GO-BP和GO-MF富集分析，并将基因结果进行可视化，如图5。生物过程的富集结果主要集中在对脂多糖和氧含量的调节、损伤反应、细胞运动的正调节以及凋亡信号通路的负调控等。细胞组成主要包括参与膜筏组织的蛋白、细胞外基质、粘着斑、线粒体被膜、内质网内腔以及分泌颗粒内腔等，表明药物的活性成分会与多种蛋白相结合而发挥治疗疾病的作用。就分子功能而言，药物治疗仔猪细菌性腹泻的作用主要与细胞因子的活性、血红素的结合、蛋白酶结合以及与DNA结合转录因子结合等分子功能相关，这些分子功能主要参与炎症反应、蛋白质和药物的选择性作用，从而影响机体的结构和功能。

图5 GO富集分析结果Fig. 5 GO enrichment analysis results

2.6.2 KEGG通路分析 将核心靶点进行KEGG通路富集分析，不难发现IL-17信号通路、HIF-1信号通路(排除与仔猪腹泻无关的通路)等主要在炎症反应、免疫调节以及细胞凋亡等方面发挥作用，这与GO富集结果具有一致性，说明苦白石颗粒主要活性成分的作用靶点是多条不同通路、多种成分、多个靶点相互作用的，如图6。

图6 KEGG富集分析结果Fig. 6 KEGG enrichment analysis results

2.7 对接结果 分子对接结果显示，苦白石颗粒中DC值最高的3个化合物分别与治疗核心靶点一一进行对接，这些关键成分与核心靶点蛋白的结合能普遍较高，如表3，这进一步表明AG可能通过多组分靶通路模式发挥治疗仔猪细菌性腹泻的作用，部分可视化结果如图7。

Luteolin—TNF Quercetin—TNF Kaempferol—TNFLuteolin—IL6 Quercetin—MMP1 Luteolin—ICAM-1图7 分子对接可视化结果Fig. 7 Visualization results of molecular docking

表1 3个化合物与核心靶点分子对接结果Table 1 Docking results of three compounds with core target molecules

3 讨论与结论

武超[21]利用网络药理学分析了苦参止痢颗粒治疗仔猪腹泻的有效成分及作用机制，陈志飞[22]研究了黄芪防控猪繁殖与呼吸综合征的物质基础及靶点信息，均是中兽医药领域通过网络药理学手段对中药复方进行的有益探索。中兽医学具有整体观念和辨证论治的中医理论特点，中药复方通过多组分、多途径、多靶点协同发挥作用；中药网络药理学则是对药物分子-靶点-疾病构建的生物信息网络进行综合分析，从而识别中药的有效成分，阐释其作用机制，两者不谋而合，为中兽药的开发提供了新的研究思路和手段[23]。

研究发现，木犀草素、槲皮素等通过干扰PEDV复制影响感染初期，具有抗猪流行性腹泻的活性，与化学药物利巴韦林、干扰素-α等相比，具有低毒高效的优势[24,25]。对LPS诱导的氧化应激体外实验[26]发现，木犀草素具有抗氧化和抗菌活性，能有效地保护猪肠上皮细胞抵抗革兰氏阴性菌，预防和治疗猪胃肠道感染；通过减缓体重减轻，降低腹泻评分，抑制十二指肠、结肠的绒毛缩短、空泡化，促进粘液蛋白的生成，预防和治疗小鼠肠黏膜炎引起的肠道损伤[27]。槲皮素作为天然抗氧化剂，可缓和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导的家畜胃肠道细胞毒性和氧化应激反应，通过促进肠上皮细胞Nrf2蛋白丰度、调节GSH相关氧化还原稳态来减轻肠细胞损伤，对弗氏志贺菌诱导的大鼠感染性腹泻，槲皮素显著降低粪便密度和含水量，并恢复血液参数、抗氧化状态和促炎细胞因子(IL-6和TNF-α)表达，这些发现证实槲皮素在维持肠道稳态中的作用和有效的抗腹泻活性[28-30]。山奈酚具有抗氧化、抗凋亡等多种生物活性，能够改善猪肠上皮细胞的氧化损伤和凋亡，减轻肠屏障功能障碍[31]。

TNF-α是导致胃肠道炎症易感和恶化的主要介质，可在受损的肠粘膜中大量表达，表达量越高，其病变范围越大、越严重，仔猪感染腹泻后，TNF-α显著提高了IL-6和IL-8的表达水平，促炎细胞因子通过直接诱导信号分子或间接刺激细胞增殖，从而在免疫应答中发挥重要作用[32]。

通路分析结果发现，IL-17信号通路是苦白石颗粒治疗仔猪细菌性腹泻过程中最重要的信号通路之一，该通路在急、慢性炎症反应中起着举足轻重的作用，IL-17 是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以促进T 细胞的激活和刺激上皮细胞等产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、CAM-1等，放大炎症反应[33]。另外，多种胃肠道疾病的病因与氧化应激有关，研究发现药物作用使HIF-1信号通路中HIF-1α表达降低，下游COX-2的表达上调，表明肠粘膜对缺氧的适应性反应，减轻了仔猪肠道的损伤[34]。

从网络药理学的角度探讨了苦白石颗粒在仔猪细菌性腹泻防治中的有效成分及作用机制，并利用分子对接技术进行了初步验证，木犀草素、槲皮素、山奈酚等活性成分作用于TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶点，进而调控IL-17、HIF-1等信号通路，参与抑制炎症反应、调节免疫、抗感染等生物过程。下一步将通过实验验证的方法对苦白石颗粒作用的靶点和通路进行充分研究。