一株1型非洲马瘟疫苗毒种的初步鉴定

王静文，张 敏，宋亚芬，张 兵，张桂铭，王 磊，苗清新，陈 玲，杨承槐

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

非洲马瘟是由非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus, AHSV)引起的以马属动物为主的非接触性传染病，以发热、皮下水肿及脏器出血为主要特征，临床上多表现为急性或亚急性，感染马匹的致死率最高可达95%，被OIE列为必须上报的动物传染病，同时也是我国一类疫病中唯一的马属动物疫病[1]。我国是OIE认可的非洲马瘟无疫国，历史上从未发生过非洲马瘟。2020年3月以来，泰国和马来西亚相继暴发非洲马瘟疫情，已引起500多匹马匹死亡，这不仅是时隔60年后亚洲地区再次发生非洲马瘟疫情，也是在非洲大陆外首次出现血清1型AHSV(AHSV-1)的流行[2-3]。随着国际贸易的深化和该疫情在东南亚地区的传播，非洲马瘟传入我国的风险亦随之增大[4]。

为应对传入风险，2020年3月28日海关总署发布《关于泰国非洲马瘟传入的警示报通报》,4月1日海关总署联合农业农村部发布《关于防止泰国非洲马瘟传入我国的公告》(2020年第48号)[5]，同年9月11日，海关总署再次联合农业农村部发布《关于防止马来西亚非洲马瘟传入我国的公告》(2020年第105号)[6]。

2020年4月22日，农业农村部办公厅专门印发了《关于做好非洲马瘟防范工作的通知》(农办牧〔2020〕22号)，要求各单位积极做好相关技术储备。中国兽医药品监察所负责组织开展有关非洲马瘟疫苗种毒匹配性分析，并组织具备条件企业紧急生产、储备相应数量应急用疫苗[7]。由于无特效治疗性药物，疫苗免疫是目前防控非洲马瘟最有效的方法。常见的商品化AHSV疫苗包括弱毒活疫苗和灭活疫苗。近年来随着生物技术的不断进步，新型疫苗如核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗等的研发也取得了较大进展[8]。

虽然弱毒苗的使用存在着基因重组导致的遗传变异或是毒力返强的隐患，但相对于灭活苗，弱毒苗仍是目前防控非洲马瘟的生力军。且相对于多价苗，单价苗能提供更有效的免疫保护，特别对于单一血清型病毒流行的地区，单价苗的应用更为重要。鉴于此，根据计划安排，我们对库存的一株1型非洲马瘟病毒疫苗株进行了扩繁和细胞适应性研究，并对其病毒含量、特异性、对小鼠毒力等方面做出初步鉴定。

1 材 料

1.1 毒株 AHSV-1(AV1311株)由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存。

1.2 细胞 非洲绿猴肾细胞(Vero)、仓鼠肾细胞(BHK-21)，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存并提供。

1.3 试剂 DMEM培养液、胰酶、胎牛血清购自Gibco公司；PBS溶液购自北京中海生物有限公司；RNA提取试剂盒和RT-PCR相关试剂购自Takara公司；非洲马瘟1型阳性血清引进自OIE非洲马瘟参考实验室Pirbright研究所。

1.4 实验动物 昆明小鼠、豚鼠购自北京维通利华有限公司。

2 方 法

2.1 毒种复壮 取一支AHSV-1(M3代，鼠脑组织毒)用无血清DMEM培养基进行100倍稀释后，经脑内接种18～22 g小鼠，0.05 mL/只，共接种18只，设接种生理盐水的阴性对照及不接种病毒的空白对照各3只。每日观察小鼠发病及死亡情况。及时解剖死亡小鼠并取其脑组织冻存。试验结束后，将所有死亡小鼠的脑组织取出研磨，保存于-70 ℃备用。

2.2 细胞适应及传代 取1支AHSV-1(M3代，鼠脑组织毒)用无血清DMEM培养基进行100倍稀释，接种75 cm2细胞瓶的Vero细胞，每瓶1 mL，37 ℃孵育1 h后，补加含2% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每日观察，无病变时每120 h进行一次盲传，至出现80%细胞病变时收获，反复冻融三次后，再接种Vero细胞传代。收获的病毒液保存于-70 ℃备用。

2.3 病毒含量测定 用无血清DMEM培养基进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度接种96孔板已长至良好单层的Vero细胞，每个稀释度接种5孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照组，置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育120 h。观察到期后，逐个观察每孔细胞病变情况，按照Reed-Muench法进行病毒含量计算。

2.4 小鼠毒力测定 用无血清DMEM培养基进行10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度脑内接种18～22 g小鼠，每个稀释度接种5只，每只接种0.1 mL。连续观察14 d看是否出现死亡或神经症状等，按照Reed-Muench法计算LD50。

2.5 特异性试验

2.5.1 PCR法 取F2代的细胞扩繁毒，按照Takara试剂盒说明书提取病毒RNA并进行反转录后，根据OIE推荐的参考引物，进行PCR扩增。引物序列(表1)和扩增条件如下。

95 ℃ 5 min预热后进行如下30个循环(94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 8 min，4 ℃+∞。在确定分型为AHSV-1型的毒株基础上，扩增VP7基因PCR条件如下：95 ℃ 5 min预热后，进行如下30个循环(94 ℃ 1 min，53 ℃1 min，72 ℃ 2 min)，72 ℃ 8 min，4 ℃+∞。将条带正确的PCR产物送中美泰和有限公司进行测序。

2.5.2 血清中和实验 随机抽取1支F25代细胞适应毒，用细胞培养液稀释至200 EID50/0.1mL。取1 mL与等体积倍比稀释的非洲马瘟1型阳性血清混合，37 ℃作用1 h(期间振摇1次)，接种5孔长成单层的Vero细胞，每孔0.1 mL，同时设置病毒对照组和空白对照组。置于37 ℃孵育，观察记录120 h内出现CPE的孔数。

3 结果与分析

3.1 毒种复壮及细胞扩繁 经脑内接种AHSV-1(M3代)的昆明小鼠，在接种后72 h开始发病，主要表现为精神沉郁，食欲减退，弓背，呼吸微弱且出现明显的神经症状，剖检发现死亡及濒死小鼠脑组织可见严重出血，96 h后小鼠全部死亡。收集死亡小鼠脑组织，制备一批鼠源基础种毒，小鼠发病症状和剖检情况见图1。

A. 脑内出血症状；B. 精神沉郁、弓背；C. 强直等神经症状；D.接种生理盐水对照A. Intracerebral hemorrhage；B. Depression and hunchbacked；C. Muscle Rigidity；D. Negative Control with saline图1 脑内接种小鼠临床症状Fig 1 Clinical signs in inoculated mice

病毒接种Vero细胞后盲传至第5代时，可在接种后144 h出现细胞病变，主要表现为细胞变圆、皱缩，开始脱落(图2)。自第6代开始，孵育120 h后可出现细胞病变，继续传代至第10代后可稳定在48～72 h内出现细胞病变。

A. F3代48 h Vero细胞病变；B. F10代48 h Vero细胞病变；C. F15代48 h Vero细胞病变；D. 正常细胞对照A. 48 h CPE of F3-passage; B. 48 h CPE of F10-passage;C. 48 h CPE of F15-passage; D. Normal Control图2 AHSV在Vero细胞上引起的细胞病变(1000×)Fig 2 CPE in Vero cell caused by AHSV

3.2 病毒含量测定 采用Vero细胞测定AHSV-1不同代次毒种的病毒含量，结果显示F10、F15、F20代病毒含量分别为106.5、106.5和106.8TCID50/0.1mL，符合《OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册》中对非洲马瘟疫苗病毒含量的要求。

3.3 对小鼠毒力测定结果 AHSV-1细胞扩繁毒 F10、F15、F20代对小鼠的半数致死量分别为106.5、106.8和106.5LD50/0.1mL，鼠源基础种毒对小鼠的半数致死量为107.8LD50/0.1mL。

3.4 特异性分析结果 根据群特异性引物，可扩增得到约229 bp的AHSV-1型特异性条带(图3)，同时以该毒株为模版，扩增VP7基因可得到长度为1179 bp的条带(图4)。测序结果经Blast比对发现，该毒株与AHSV 1180株(基因序列号为KP009718)同源性达99.47%，同为血清1型，与2020年泰国暴发的疫情病原核苷酸同源性可达96.47%。血清学试验亦表明，该病毒可被非洲马瘟1型阳性血清完全中和，特异性良好。

M：Marker; Sample：AV1311-M3/F10/F15/F20; NC：Negative control图3 分型PCR电泳图Fig 3 Electrophoretogram of type-specific gel-based RT-PCR

M：Marker; Sample：AV1311-M3/F10/F15/F20; NC：Negative control图4 VP7基因扩增PCR电泳图Fig 4 Electrophoretogram of VP7-gene amplification

4 讨 论

2022年3月30日，OIE宣布我国浙江省杭州市桐庐县为无规定马属动物疫病区，这对于提升我国在全球动物卫生领域的影响力具有重要意义[9]，也对我国防控非洲马瘟提出了更高要求。因无特效治疗性药物，疫苗免疫成为防控非洲马瘟最有效的方法[10-11]。

常见AHSV疫苗主要包括弱毒活疫苗和灭活疫苗。20世纪80年代末，商品化灭活疫苗曾被广泛用于西班牙、葡萄牙和摩洛哥等地的疫情防控，但因生产成本高、安全风险大等原因，目前已停产[12]。AHSV弱毒苗研究始于20世纪30年代的南非，通过将多株AHSV在小鼠脑内进行约100次连续传代，成功获得嗜神经性人工致弱毒株，并利用其制备了多价弱毒苗。试验结果证明，这种嗜神经性毒株制备的弱毒苗可诱导较高滴度的中和抗体[8]。20世纪60年代之后，利用细胞培养的疫苗毒逐渐取代了上述弱毒苗，并在中东及北非等地区广泛应用。20世纪90年代，南非生产的两种4价弱毒苗 (一种含1、3、4、5型抗原，另一种含2、6、7、8型抗原) 对非洲地区的非洲马瘟起到了有效的防控作用。然而，有报道称5型 AHSV 可对动物产生不良影响甚至导致其死亡，因此基于安全考虑，含5型病毒的弱毒苗于20世纪90年代初停止使用。南非OBP公司生产的多价疫苗是最为经典的非洲马瘟弱毒苗，多年来在南非等地广泛使用[13]。该弱毒苗由两种疫苗构成，即疫苗I和疫苗II。疫苗I含1、3、4型抗原；疫苗II含2、6、7、8型抗原，免疫程序为用疫苗I对动物进行首免，3周后用疫苗II对其进行二免。各国通常针对本国疫情流行特点制定相关单价苗或多价苗的免疫策略，对于单一血清型病毒流行的地区，单价苗的应用更为重要[14]。

AHSV共有9个不同的血清型，之间存在一定的交叉反应。为做好紧急防控，此次疫苗种毒扩繁和鉴定工作主要围绕AHSV-1展开。本试验所用原始毒株为中监所老专家于1960年代从国外引进，年代久远，其来源背景和病毒活性等情况不是很清楚，且引进毒均为鼠脑组织毒，不便于疫苗的大规模生产。我们经小鼠脑内接种复壮后，证明病毒具有繁殖活性，且选用18～22 g体重区间的小鼠，潜伏期更短，出现症状更快。在细胞驯化试验中也采用了鼠源细胞BHK-21作为对比。虽然病毒在BHK-21细胞上的增殖速度较Vero细胞更快，出现病变时间也更早，但考虑到BHK-21细胞存在致瘤性问题，我们仍选择在Vero细胞上进行病毒鉴定的后续研究。不同代次病毒含量测定结果表明，病毒含量随着代次增高趋于稳步提升，且该Vero细胞适应毒对小鼠也能保有相应的毒力。

AHSV属于呼肠孤病毒科，环状病毒属，其基因组由10个双链RNA片段组成，编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)，其中VP7是形成内衣壳的主要蛋白，相对比较保守；VP2蛋白变异性最高，有15个抗原位点，是主要的血清型特异性抗原。RT-PCR检出率高、特异性强，且快速便捷，是OIE推荐的检测方法[15-16]。赵文华等基于AHSV L2片段设计了型特异性引物，可对9个血清型进行分型，基于S7片段设计了2对引物，可检测出6种血清型(2、3、4、7、8和9)的AHSV[17]。此外，荧光定量RT-PCR法也逐步建立，如赵文华等根据VP7蛋白ORF全长建立的“三步法”，可对全部9个血清型扩增[18]；高志强等建立了VP7蛋白和NS2蛋白的双重Taqman荧光定量法，灵敏度更高，有效降低漏检率[19]。本实验中，我们采用的是OIE推荐的通用型引物和自行设计的型特异性引物，建立了AHSV通用型及分型分子鉴别方法，经扩繁的鼠源毒和细胞毒验证具有良好的敏感性和特异性，可用于毒种的快速鉴别检验。Napawan Bunpapong等使用纳米孔测序技术对8株2020年泰国分离株分析发现，所有毒株在95V，166S和660I位置都含有独特的氨基酸，提示传入泰国的毒株为同一分支[20]。经比对VP7基因保守区域发现，该毒株与泰国疫情毒株的VP7蛋白只有一个氨基酸的差异，氨基酸同源性达99.7%，可作为一株良好的疫苗毒株候选株。

需要特别说明的是，因AHSV的特殊性，所有试验均经主管部门审批后，严格在ABSL-3实验室按照生物安全要求操作，严防病毒的泄漏或扩散[21]。非洲马瘟虽不属于人兽共患病，但亦有报道显示一种疫苗毒株可导致人的脑炎和视网膜炎[22]。下一步拟按照《OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册》中关于疫苗毒种的要求，采用蚀斑技术对该毒种进行克隆纯化，并评价其安全性与免疫原性，以进一步完善生产用毒种的鉴定；同时开展RT-PCR和ELISA抗体检测方法研究，为建立我国高风险地区乃至整个亚太地区非洲马瘟快速预警和监测机制提供技术支撑。