鸡源葡萄球菌携带cfr与tet(M)基因于同一质粒的检测

程于梦,杨梦艳,于润浩,李德喜

(河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450046)

葡萄球菌(Staphylococci)是一种化脓性革兰氏阳性球菌,在自然界中普遍存在,能够产生外毒素(肠毒素),可能导致家禽出现败血症等多种病症,在猪身上表现为出现渗出性皮炎等症状,是引起人类食物中毒和动物细菌感染的重要微生物。近年来,人们治疗细菌感染的首选药物就是抗生素,在抗生素的压力下,细菌产生了耐药性,甚至出现了“超级细菌”。2011年,世界卫生组织将“控制抗生素耐药性”作为世界卫生日的主题,这标志着细菌耐药性将成为21世纪面临的最严重的问题之一。

利奈唑胺(linezolid)是美国FDA在2000年新批准的恶唑烷酮类药物,该药物的作用机制独特,细菌对其的耐药比例较低[1-3]。在细菌对利奈唑胺耐药的机制中,除了核糖体L3、L4和23S rRNA突变外,质粒介导的cfr基因对该类药物的耐药也发挥了重要作用[4]。目前cfr基因在葡萄球菌和肠球菌中的流行情况越来越严重,因此应该逐步加强对cfr基因的监测与防控。

cfr基因是Schwarz等在2000年从呼吸道感染的小牛鼻腔拭子中分离的松鼠葡萄球菌上首次发现的。通过质粒分析试验和抗生素敏感性测定，发现该菌株携带1个17.1 kb的质粒pSCFS1[5]；该质粒包含1个编码349个氨基酸序列的开放阅读框,能够介导氯霉素和氟苯尼考耐药,因此将之命名为cfr(Chloramphenieol florlenicol resistance)[6]；cfr基因主要通过基因编码修饰RNA甲基转移酶23S rRNA基因第2503位的腺嘌呤残基引起细菌核糖体甲基化,阻止作用于肽基转移酶中心的许多抗生素的结合,减少或消除抗生素的功能，实现对药物产生抗性[7]。

本研究发现了1株耐多药的葡萄球菌株,该菌株对四环素、酰胺醇类和恶唑烷酮类药物耐药。本文主要探究了何种耐药机制导致该菌株多重耐药的形成。

1 材料与方法

1.1 工程菌株、实验药品和试剂

金黄色葡萄球菌RN4220，由本实验室保存；氟苯尼考，购自浙江海翔药业有限公司；利奈唑胺，购自美仑药业公司；四环素，购自湖北恒硕制药有限公司；环丙沙星，购自山东金太阳制药有限公司；庆大霉素，购自江苏涟水制药有限公司；氯霉素、红霉素，购自中国兽医药品监察所； Premix Taq酶，购自宝生生物有限公司； DL2000 DNA Marker，购自北京百泰克生物技术有限公司；细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；质粒中提提取纯化试剂盒，购自德国Qiagen公司。

1.2 野生菌株的分离与鉴定

将本实验室于-80 ℃保存的野生株在显色培养基琼脂板上画线,置于37 ℃恒温箱培养24 h；用无菌接种环挑取培养长出的白色或粉色单菌落，重新接种于显色培养基琼脂板上进行纯化增菌培养；从培养基上挑取白色或粉色的葡萄球菌单菌落,接种于2 mL的氯化钠肉汤中,放置于37 ℃恒温摇床上，以210 r/min震荡培养过夜,然后保存菌液，及时进行细菌DNA基因组的制备。

从NCBI Genbank中调出cfr、tet(M)、erm(B)基因序列,采用Primer 5.0软件设计引物,对野生株STR-9进行16S rRNA细菌种属鉴定。将引物送至北京六合华大基因科技有限公司进行合成。用于PCR扩增的引物序列见表1。

表1 cfr与tet(M)的PCR扩增引物序列

1.3 药物敏感性试验

细菌对药物的敏感性试验采用微量肉汤稀释法,以金黄色葡萄球菌工程菌RN4200为质控菌。药敏试验需要的药物包括氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四环素、红霉素、沃尼妙林、庆大霉素、环丙沙星、链霉素、利福平等。药物敏感性的判定按照美国临床微生物药敏试验判定标准[8]执行。当第12孔阴性对照无菌落生长,而第11孔阳性对照有明显生长时,读取该次药敏试验结果。

1.4 电转化试验

提取野生菌株STR-9的质粒:使用德国Qiagen公司的试剂盒提取质粒DNA；将培养菌液1 mL接种于300 mL BHI肉汤中，于37 ℃恒温摇床中培养过夜。

制备感受态细胞:将金黄色葡萄球菌RN4200接种于BHI肉汤中,于37 ℃恒温摇床中培养；在培养2 h后,每隔15～20 min在578 nm波长处测定1次菌液的OD值,当OD值达到0.5～0.6时开始制备感受态细胞[9]；在制备完成后，将RN4220感受态细胞按照100 μL等份分装于1.5 mL离心管中,保存于-80 ℃冰箱，备用。

电转化试验[9]:将转化后的菌株涂布于含有氟苯尼考(终浓度为10 mg/L)的BHI琼脂中，于37 ℃恒温箱中培养24～48 h,观察电转子的生长情况。

2 结果与分析

对野生株STR-9进行16S rRNA细菌种属鉴定,测序结果显示该野生株为松鼠葡萄球菌。从图1和图2扩增结果可以看出在STR-9的基因组中存在cfr与tet(M)[10]耐药基因。从表2药敏试验结果[8]可以看出,标示为野生株的松鼠葡萄球菌STR-9对氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四环素、沃尼妙林、庆大霉素和链霉素表现耐药；根据STR-9对利福平、红霉素表现出高度耐药的试验结果，其可能含有相应的erm(B)耐药基因；对STR-9的基因组进行erm(B)耐药基因的PCR扩增,试验结果显示为阳性。

M, Marker; 1, STR-9。

获得的电转子DT-9对氟苯尼考、沃尼妙林、四环素和利奈唑胺等抗生素表现耐药,对链霉素、环丙沙星和利福平表现为敏感,表示未携带上述抗生素的耐药基因。对电转子DT-9进行cfr、tet(M)与erm(B)基因扩增,cfr、tet(M)结果均为阳性,而erm(B)基因并未检出,说明cfr、tet(M)耐药基因位于STR-9的质粒上,而erm(B)基因可能位于该野生株的染色体上,且cfr与tet(M)耐药基因可以随质粒的移动进行转移。测序结果分析发现,cfr和tet(M)基因共存于同一质粒,质粒结构见图3。

M, Marker; 1, STR-9。

表2 cfr阳性葡萄球菌和电转子药敏试验结果

注: CHL,氯霉素; FFC,氟苯尼考; LZD,利奈唑胺; TET,四环素; ERY,红霉素; VAL,沃尼妙林; GEN,庆大霉素; CIP,环丙沙星; STR,链霉素; RIF,利福平。

图3 全质粒测序分析结果

3 讨论

通过对cfr基因的研究现已证实,cfr基因至少可以导致5类药物(酰胺醇类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类、林可胺类、链阳菌素A类)耐药。本研究发现了1株对多种药物耐药的葡萄球菌,经PCR检测发现其含有cfr基因；电转化试验及药敏试验结果证明,该菌不仅对上述5类化学结构不同的药物耐药,并同时含有四环素的耐药表型,且tet(M)结果为阳性；分析发现其cfr基因和四环素耐药基因tet(M)共存于同一质粒,在遗传元件的参与下容易扩散转移,并且该菌株的质粒通过电转化试验可以转移到金黄色葡萄球菌RN4200感受态细胞中,证明了该质粒的可移动性,这种现象可能是在抗生素的选择压力下促成的,因此,我们要加强多药耐药基因cfr的监测与防控。

据相关研究报道,cfr基因大多位于质粒上,易于在动物源、环境和人之间进行水平传播并转移扩散,cfr基因陆续在多种动物中被发现,如鸡、鸭、猪的葡萄球菌,猪、牛等动物的肠球菌[11]。在肠球菌和芽孢杆菌中分离得到了cfr基因[12-15],发现了与cfr基因共存于同一质粒的其他基因,如cfr与erm(A)、cfr与erm(A)基因共存于芽孢杆菌同一质粒中；erm(A)表现出对大环内酯类抗生素耐药,而且它很可能发生变异,因而会加大治疗细菌感染的难度。已有报道证明具有可转移性的基因cfr和optrA共存于葡萄球菌质粒中[16],如果这种现象扩散到人医临床,必将严重影响临床治疗的效果。

综上所述,如何减少cfr耐药基因在葡萄球菌的出现,从而延长酰胺醇类与恶唑烷酮类抗生素的使用寿命已经成为一个全球关注的热点问题,同时对其耐药机制进行深入研究,开发新型抗生素等迫在眉睫。为了减少多重耐药基因cfr的进一步扩散,我们要加强对该基因的监测与防控。