氟苯尼考对克氏原螯虾药物代谢酶及相关基因表达的影响

张新灿，李小定

华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070

克氏原螯虾俗称小龙虾，因其繁殖速度快、生长迅速、能适应复杂环境，已成为我国长江中下游地区主要的水产养殖品种。但克氏原螯虾在养殖过程中容易遭受疾病的侵害，药物使用仍然是目前疾病防治的主要手段，因此克氏原螯虾的用药问题逐渐成为人们关注的焦点。氟苯尼考因抗菌谱广、疗效显著等特点，常用于鱼虾病害防治［1］，但其不合理使用或过量使用不仅会对养殖生物和环境造成不利影响，在食品中的残留甚至会影响人类健康，因而其在可食性动物组织中的代谢和残留已经引起广泛关注。目前，关于氟苯尼考作为药物使用仅在凡纳滨对虾［1］、鳕［2］、鲑［3］、虹鳟［4］等水产动物中有相关报道，但是，在克氏原螯虾养殖中的应用偏少，研究尚在起步阶段。因此，本研究使用在饲料中分别掺拌10、20、30 mg/kg 氟苯尼考的人工配合饲料喂养克氏原螯虾20 d 并进行15 d 的药物消除试验，测定克氏原鳌虾肝胰腺Ⅰ相药物代谢酶CYP450 亚族CYP1A、CYP2E 和CYP3A 的代表酶7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶（ECOD）、7-乙氧基异吩恶唑酮-O-脱乙基酶（EROD）、苯胺-4-羟化酶（AH）、红霉素-N-脱甲基酶（ERND）、氨基比林-N-去甲基化酶（AND）活力变化，Ⅱ相药物代谢酶谷胱甘肽S-转移酶（GST）、磺基转移酶（SULT）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）活力变化，以及CYP450、GST、热休克蛋白HSP70、金属硫蛋白（MT）基因表达水平的变化，探讨药物代谢酶和相关基因对氟苯尼考的生物响应及其在氟苯尼考代谢过程中的作用，旨在为克氏原螯虾养殖中氟苯尼考的合理使用、科学联合用药及控制药物残留提供科学依据，同时也为克氏原螯虾健康养殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验饲料的配制

试验用饲料为自制的人工配合饲料，基础饲料（粗蛋白28%，粗脂肪3%，粗灰分20%，总磷1%，钙0.6%，赖氨酸1.2%，水分12%）经粉碎后过0.25 mm筛网，按比例分别加入10、20、30 mg/kg 的氟苯尼考标准品（HPLC≥98%，Sigma-Aldrich 公司），混匀后加水搅拌，用小型绞肉机加工成条状，50 ℃烘干后用粉碎机破碎成颗粒，即得氟苯尼考人工配合饲料，4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验动物分组及管理

克氏原螯虾（体质量20～35 g）购于华中农业大学校内农贸市场，使用基础饲料驯化7 d 后开始试验，每天定时观察，剔除死虾。试验开始时挑选附肢完整、健康强壮、有活力的克氏原螯虾，随机分成4组，每组3个平行，每个平行20尾虾。

1）试验分组。C0组（对照组），投喂基础饲料；试验组C10 组、C20 组、C30 组，分别投喂氟苯尼考添加量为10、20、30 mg/kg的人工配合饲料。

2）饲养管理。克氏原螯虾饲养于塑料箱（800 mm×600 mm×340 mm）中，水温（25±1）℃，水深（4±0.5）cm，放入适量水草、泥沙作为隐蔽物，静水连续充氧，每日定时换水1/2，每日按虾体质量的5.0%～8.0%投喂饲料，于08：00 和20：00 各投喂1次，饲养20 d 后全部改用不含氟苯尼考的基础饲料继续喂养15 d进行消除试验。

1.3 样品采集

分别在第1 次给药后第5、10、15、20、25、30、35天取试验组和对照组的克氏原螯虾，用自来水将其表面冲洗干净，解剖取肝胰腺，用生理盐水冲洗残留血液，-80 ℃保存。

1.4 肝胰腺S9微粒体的制备

采用沈钧等［5］改进的方法，肝胰腺用4 ℃的磷酸盐缓冲液冲洗3 次，每次滤纸吸干并称质量，按1∶5（W/V）的比例加入预冷的匀浆缓冲液（0.1 mol/L、pH=7.5 的磷酸缓冲液，含1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟、1 mmol/L 丙基硫氧嘧啶、0.1 mmol/L 二硫苏糖醇和15%甘油），冰浴匀浆，匀浆液在4 ℃、12 135 r/min 离心25 min，用吸管吸去漂浮的酯类物质，上清液即肝胰腺S9微粒体，取上清液至预冷的离心管备用。

1.5 代谢酶活力测定

Ⅰ相药物代谢酶CYP450 各亚族选取的代表酶为ECOD、EROD、ERND、AND。Ⅱ相药物代谢酶选取的代表酶为GST、SULT、UGT。酶活力测定使用齐一生物科技（上海）有限公司和上海江莱生物科技有限公司提供的试剂盒进行。

1.6 总RNA提取、cDNA合成及引物设计

采用Trizol 法提取总RNA［6］，通过分光光度法（D260/D280）和1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA 的纯度和完整性，使用TaKaRa 反转录试剂盒反转录得cDNA。采用荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因CYP450、GST、HSP70、MT的表达，以β-actin作为内参基因。目的基因引物根据GenBank 序列设计，引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR assay

1.7 qRT-PCR检测

采用VAZYME（SYBR Green Master Mix）试剂盒进行qRT-PCR 分析。cDNA 稀释6 倍，荧光定量反应体系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，正向引物（10 μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 4 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，灭菌水4.8 μL。反应过程：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃15 s；60 ℃60 s，95 ℃15 s，40 个循环；以0.5 ℃/s从60 ℃升温到95 ℃绘制熔解曲线。

使用Thermo Scientific Pikoreal Real 软件2.1（Thermo）对数据进行分析，目的基因的相对表达量用2-ΔΔCt法［7］计算。

1.8 数据处理

试验数据用“平均值±标准差”表示，使用Origin 2021 软件作图，IBM SPSS Statistics 26 进行单因素方差分析，Duncan’s 法进行显著性分析，P＜0.05为显著性差异判别标准。

2 结果与分析

2.1 氟苯尼考对ECOD和EROD活力的影响

由图1 可见，投喂氟苯尼考后，ECOD 和EROD活力降低。投喂氟苯尼考后第10 天，所有试验组ECOD 和EROD 活力与对照组相比均有显著性差异，之后持续降低（P＜0.05）。消除试验阶段，C10组和C20 组ECOD、EROD 活力开始恢复，并在第35 天恢复至正常水平，与对照组相比没有显著性差异，C30 组ECOD 和EROD 活力较投药期变化不大，停药后第35天仍显著低于对照组（P＜0.05）。

图1 克氏原螯虾肝胰腺ECOD（A）、EROD（B）活力变化Fig.1 Changes of ECOD（A）and EROD（B）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.2 氟苯尼考对AH活力的影响

投喂氟苯尼考后克氏原螯虾肝胰腺AH 活力变化如图2所示，试验组AH活力逐渐降低，第5天开始C30组AH活力显著低于对照组，并且在第20天降为最小值，第10 天开始C10 组和C20 组AH 活力也显著低于对照组，在第20 天降为最小值（P＜0.05）。30 mg/kg 氟苯尼考对克氏原螯虾肝胰腺AH 的抑制作用最强，10 mg/kg 氟苯尼考的抑制作用最弱。消除试验结果显示，氟苯尼考停喂后，试验组AH 活力逐渐升高，均在第35天恢复至正常值，与对照组相比没有显著性差异。

图2 克氏原螯虾肝胰腺AH活力变化Fig.2 Changes of AH activity in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.3 氟苯尼考对ERND和AND活力的影响

由图3 可见，投喂氟苯尼考后试验组ERND、AND 活力降低，且呈现降低的趋势，在第20 天降为最小值。消除试验阶段，试验组ERND、AND活力开始恢复，C10 组ERND 活力在第30 天恢复至正常值，AND 活力在第35 天恢复至正常水平，与对照组相比没有显著性差异。C20 组和C30 组ERND、AND 活力变化不大，35 d 后，ERND 活力仍显著低于对照组（P＜0.05）。

图3 克氏原螯虾肝胰腺ERND（A）、AND（B）活力变化Fig.3 Changes of ERND（A）and AND（B）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.4 氟苯尼考对GST、SULT、UGT活力的影响

投喂氟苯尼考后，克氏原螯虾肝胰腺GST、SULT、UGT 活力变化如图4 所示，试验组SULT 和UGT 活力升高，第10 天开始与对照组相比有显著性差异，试验组GST 活力在第15 天开始与对照组相比有显著性差异，试验组3 种酶活力均在第20 天达到最大值（P＜0.05）。消除试验结果显示，消除期过后，C10 组和C20 组GST 活力仍维持在较高水平，较投喂氟苯尼考期间没有太大变化，仍显著高于对照组，而C30组GST 活力逐渐降低并恢复至正常水平，与对照组相比没有显著性差异，C10 组和C20 组SULT活力逐渐恢复至正常水平，而C30组SULT活力降为正常值后仍继续降低并且显著低于对照组，所有试验组UGT 活力逐渐降低并恢复至正常水平，且与对照组相比没有显著性差异（P＜0.05）。

图4 克氏原螯虾肝胰腺GST（A）、SULT（B）及UGT（C）活力变化Fig.4 Changes of GST（A），SULT（B）and UGT（C）activities in hepatopancreas of Procambarus clarkii

2.5 氟苯尼考对克氏原鳌虾基因mRNA 表达的影响

对克氏原螯虾肝胰腺相关代谢基因mRNA 表达量进行测定，结果显示，投喂氟苯尼考20 d 后，试验组CYP450mRNA 表达上调，并且显著高于对照组（P＜0.05）。C10 组GST和HSP70mRNA 表达量上调，但在C20组和C30组中的表达下调。投喂氟苯尼考剂量越高，MTmRNA 表达量越低，C10 组和C20组MTmRNA表达上调，显著高于对照组（P＜0.05），但C30组MTmRNA表达量与对照组相比没有显著性差异。消除期过后，C20组和C30组CYP450mRNA表达量仍维持在较高水平，但C10组CYP450mRNA表达下调并恢复至正常水平。所有试验组GSTmRNA 表达下调并恢复至正常水平。C10 组HSP70mRNA 表达量与对照组没有显著差异，但C20 组和C30 组HSP70mRNA 表达量显著低于对照组（P＜0.05）。C20 组MTmRNA 表达量仍维持在较高水平，但C10 组和C30 组MTmRNA 表达量恢复至正常水平。

图5 克氏原螯虾肝胰腺基因表达Fig.5 Gene expression in hepatopancreas of Procambarus clarkii

3 讨 论

3.1 氟苯尼考对代谢酶的影响

CYP450 酶系是生物代谢药物的第一阶段酶系，与药物的代谢有密切关系［8］，CYP450 酶活力可被药物诱导或抑制，CYP450 酶也可影响药物的代谢进程，影响药物的正常疗效［9］。ECOD、EROD，AH，ERND、AND 分别是CYP1A、CYP2E 和CYP3A 亚族的标志酶，是生物体内参与药物Ⅰ相代谢反应的重要解毒酶［1］。GST、UGT 和SULT 是Ⅱ相代谢反应中重要的药物代谢转移酶，GST 可催化外源性物质的亲电基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合［10］，SULT 是机体内催化多种外源性化合物硫酸化代谢的关键酶，使外源性化合物更能有效地排出体外，从而达到解毒的目的［11］，UGT 可催化外源性化合物生成葡萄糖醛酸结合物［12］。本试验发现投喂氟苯尼考后，克氏原螯虾肝胰腺5 种Ⅰ相代谢酶活力降低，说明肝胰腺细胞中氧化酶数量不断减少，而稳定后的状态说明氟苯尼考不能无限制抑制氧化酶，这与前人研究发现药物对水产动物CYP450 酶大多表现为抑制作用一致［13］，所以推测这些酶参与氟苯尼考在克氏原螯虾体内的代谢反应。此外，该结果说明经CYP450 酶代谢的氟苯尼考在肝脏中首过效应降低，生物利用度增加，使用时要充分考虑其用量［12］。我们发现氟苯尼考对不同CYP450酶的抑制效果不同，推测在氟苯尼考代谢的过程中，不同CYP450酶与氟苯尼考可能存在竞争机制和选择性，或者可能是由于不同的酶结构所致［14］，这表明不同亚群酶在抑制时间或抑制程度上存在差异。试验组GST活力在投喂氟苯尼考15 d 后显著高于对照组，迟于5 种CYP450 酶，说明氟苯尼考或其代谢产物在体内积累，减弱了CYP450 酶的代谢结合能力，GST 迅速对这些物质进行解毒，缓解机体代谢压力［15］。SULT和UGT 也被氟苯尼考诱导，但发挥作用的时间与GST 不同，这种差别表明这3 种酶在克氏原螯虾中是独立地发挥作用。而消除试验结果表明，消除期过后，C10 组5 种Ⅰ相代谢酶活力均恢复至正常水平，说明克氏原螯虾可通过自身的调节机制完成氟苯尼考的代谢，避免造成机体损伤。而用20 mg/kg和30 mg/kg氟苯尼考喂养克氏原螯虾在停喂氟苯尼考后继续用普通饲料饲养15 d，部分酶活力还不能恢复，表明高剂量氟苯尼考超出了克氏原螯虾自身的承受能力，引起的氧化损伤破坏了酶的结构。在消除试验阶段，C10 组和C20 组GST 活力仍然较高，目的是清除氟苯尼考在体内的残留，但C30 组SULT活力显著低于对照组，原因可能是暴露期氟苯尼考剂量过高，超出了SULT 的承载力。此现象说明克氏原螯虾在氟苯尼考低剂量下能够对自身解毒机制进行调节来完成氟苯尼考的代谢，高剂量氟苯尼考对克氏原螯虾造成氧化损伤［16］。

3.2 氟苯尼考对相关基因表达的影响

本研究结果表明氟苯尼考对CYP450基因表达有显著的诱导作用，但基因表达水平与酶活力变化不一致。有研究报道，天然提取物处理的细胞中CYP1A1亚型mRNA 转录水平与蛋白表达之间没有相关性［17］，多氯联苯可诱导CYP1A1蛋白的表达，但对CYP1A1 亚型mRNA 的转录无影响［18］，这说明mRNA 转录和蛋白质表达之间可能不遵循线性关系，而是具有更为复杂的关系［13］。本试验发现氟苯尼考在转录水平上诱导CYP450mRNA 的表达，但抑制CYP450酶活力，说明此抑制作用不通过转录水平调控，而是蛋白质合成过程受阻，具体的相关机制仍有待进一步探究。投喂氟苯尼考期间，C10 组GST基因表达显著上调，说明低剂量氟苯尼考对GST基因表达有诱导作用，催化谷胱甘肽等内源性化合物与Ⅰ相代谢产物结合，减少氟苯尼考与细胞结合，降低氟苯尼考对机体产生的危害［19］。C20 组和C30 组GST基因表达量低于对照组，但GST 活力显著高于对照组，说明高剂量氟苯尼考虽抑制GST基因表达，但蛋白质合成过程可能不受影响。热休克蛋白HSP70 是广泛存在于细胞内、高度保守的可溶性蛋白［20］，生物受到刺激后，HSP70可通过维持蛋白质构象、抗凋亡、细胞保护等作用以维持机体稳态，抵抗一系列应激［21］，与生物的环境适应能力密切相关。本研究发现投喂10 mg/kg 氟苯尼考时，HSP70mRNA 表达上调，当氟苯尼考剂量增加时，HSP70mRNA 表达下调，并且低于对照组，说明高剂量氟苯尼考引起克氏原螯虾的机体损伤［13］。MT主要功能是维持生物体内必需金属元素的稳定和非必需金属元素的解毒，是一类多功能诱导性的小分子蛋白家族，MT 富含半胱氨酸，具有很强的自由基清除能力，能有效清除机体羟基自由基［22］。MT 的抗氧化作用不仅表现为能直接清除OH—，还能显著提高超氧化物歧化酶的活力，在机体解毒过程和抗氧化防御方面发挥重要的作用［16］。本研究中，氟苯尼考诱导MTmRNA 表达上调，但表达量随氟苯尼考剂量的增大而减少，说明氟苯尼考导致肝脏细胞产生自由基，引起了氧化应激，克氏原螯虾可以通过MTmRNA 表达应对低剂量氟苯尼考造成的这种改变，但高剂量氟苯尼考超出了机体的承受范围，大量的自由基对机体造成一定的损伤。

消除试验的结果表明，氟苯尼考停药15 d 后，C20组和C30组部分基因表达没有恢复至正常水平，说明高剂量氟苯尼考对克氏原螯虾造成的氧化损伤需要更长的休药期来恢复甚至不能恢复。

综上，氟苯尼考对Ⅰ相药物代谢酶具有抑制作用，但对Ⅱ相药物代谢酶具有诱导作用。基因表达结果表明，氟苯尼考可诱导CYP450基因表达上调，10 mg/kg 氟苯尼考诱导GST基因表达上调，但20 mg/kg 和30 mg/kg 氟苯尼考抑制GST基因表达，基因表达与酶活力变化不一致的现象说明基因转录与蛋白质合成之间并没有必然的联系；10 mg/kg 氟苯尼考通过诱导HSP70、MT等基因的表达维持机体的稳态，但高剂量氟苯尼考超出了机体的承受范围，引起机体损伤。因此，为安全起见，以饲料掺拌方式喂养克氏原螯虾时，建议氟苯尼考剂量为10 mg/kg，既有利于充分发挥药效而不会过早排出体外，又可避免氟苯尼考剂量过高造成克氏原螯虾机体损伤和在体内蓄积。