天麻乙醇提取物促进小鼠下肢缺血模型血管新生的作用研究*

张冰琳，夏霜莉，马琛婧，李秀芳，代 蓉

（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500）

下肢缺血性疾病是动脉狭窄或闭塞而导致肢体远端组织灌注不足的一类疾病，以动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病足最为常见[1]，有极高的致残率、致死率，危害着人类健康。在缺血性疾病发生发展过程中，机体具有一定的代偿能力，主要表现为血管新生和侧支循环建立[2]，但这种内源性的修复能力有限，尚不足以有效的缓解缺血部位的功能恢复，因此，通过药物促进缺血部位修复对下肢缺血的治疗具有重要意义。

课题组前期研究发现，天麻80%乙醇提物具有促进脑缺血再灌注损伤模型大鼠（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）脑内血管新生的作用，但其对外周缺血的作用未见报道，因此本实验通过阻断股动脉法复制小鼠下肢缺血模型，观察天麻醇提物对该模型动物血管新生的作用，为其用于治疗下肢缺血性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 TRIzolTM试剂（Thermo Fisher scientific，191012），PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser（perfect Real Time） （Takara，AGH 1533A），PowerUpTMSYBR Green，Master Mix（Thermo Fisher scientific，662399），Anti-Ki67一抗（Abcam，GR3237895-1），Tomato-lectin （Vactor laboratories，TL-1176），羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488）（Abcom，GR3176293-1），Fluorshield Mounting Medium With DAPI（Abcam，GR3182624-6），山羊血清（北京索莱宝科技有限公司，SL034），OCT（Thermo Fisher scientific，387208），DNase/RNase-Free Water（北京索莱宝科技有限公司，20180628）。

1.2 天麻醇提物 称取天麻样品500 g，粉碎，过10目筛。加80%乙醇6 L，75℃回流提取2 h后，取上清，上清为黄色液体；残渣加80%乙醇6 L回流提取2 h，合并提取液，浓缩得醇提物46 g。

1.3 仪器 激光散斑血流检测视频系统（PeriCam PS），实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 5），梯度PCR仪（ABI Veriti），冰冻切片机（CRYOSTAR NX50），荧光显微镜（Ci-L），电凝 Pro’sKit（1PKSC109B）。

1.4 实验动物 SPF级雄性昆明种小鼠，6周龄，体质量（20±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，合格证号：SCXK（辽）2015-0001。

1.5 复制小鼠下肢缺血模型及分组 昆明种小鼠注射10%水合氯醛进行麻醉，小鼠完全麻醉后，将其仰卧位固定于37℃恒温操作台，右侧腹股沟皱痕处剃毛消毒后剪一0.5 cm切口，暴露股动脉，小心分离出股神经、静脉、股动脉、髂动脉、旋股外侧动脉，用电凝阻断股动脉（位置：股动脉中靠近髂外动脉分支处下端，旋股外侧动脉上端处，注意不要损伤静脉和神经），确认无出血后缝合手术切口并消毒；术后30 min使用激光散斑检测两侧后肢血流量，缺血侧下肢血流量下降至未缺血侧50%以下为造模成功。

将实验动物随机分为模型组、假手术组、天麻醇提物1、3、7、14 d处理组，每组12只。各组小鼠造模后灌胃给予天麻醇提物0.94 g/kg，模型组、假手术组灌胃给予等量蒸馏水，给药体积均为0.2 mL/10 g体重。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 激光散斑检测血流量 用异氟烷麻醉小鼠后，将其仰卧位固定于37℃恒温操作台，右侧腹股沟皱痕处剃毛消毒，将小鼠后肢脚掌部置于激光散斑仪的红外十字投射区域，调整位置并对齐，分别监测小鼠两个后肢的血流量，并记录后肢血流的基础值。

1.6.2 免疫荧光检测新生血管 术后第7、14天，处死小鼠，取缺血侧下肢腓肠肌，置于4%多聚甲醛固定后，依次进行梯度脱水、OCT包埋、冰冻切片处理。采用免疫荧光法，检测 Ki67、Tomato-Lectin、DAPI的表达，3个指标重合区域即为新生血管，进行荧光显微镜拍照（1∶200）。

1.6.3 促血管新生因子mRNA表达的影响 给予天麻醇提物1、3、7、14 d后，取小鼠缺血下肢腓肠肌按照试剂说明提取总RNA，根据逆转录试剂盒操作说明，进行逆转录合成cDNA。以其为模板，GAPDH做内参，各血管新生调控因子引物序列见表1，反应条件：95℃变性15 s，60℃退火1 min，反应完毕，计算各基因的相对表达水平，相对表达水平等于 2-△△Ct，其中△Ct=Ct目的基因－Ct GAPDH；△△Ct=△Ct处理样本－△Ct对照样本（对照样本为假手术组）。

表1 引物序列

2 结果

2.1 各组小鼠血流量变化情况 激光散斑检测结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠手术侧血流量明显下降（P<0.001），缺血侧下肢血流量下降至未缺血侧50%的动物视为造模成功；与模型组比较，术后3、7 d，天麻醇提物组小鼠手术侧血流量增加（P<0.001），见表2、图1。

表2 天麻醇提物对下肢缺血小鼠手术侧血流量的影响（±s，n=12，%）

表2 天麻醇提物对下肢缺血小鼠手术侧血流量的影响（±s，n=12，%）

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

时间 假手术组 模型组 天麻醇提物组缺血前 1.02±0.18 0.99±0.19 0.96±0.16缺血 30 min 0.98±0.16 0.39±0.10△△△ 0.45±0.10 3 d 0.95±0.12 0.45±0.11△△△ 0.64±0.14***7 d 0.94±0.16 0.51±0.10△△△ 0.69±0.14***14 d 0.99±0.20 0.64±0.12△△△ 0.70±0.13

图1 天麻醇提物对下肢缺血小鼠血流量的影响

图2 天麻醇提物对下肢缺血小鼠7 d新生血管的影响

2.2 Tomato-Lectin、Ki67的阳性表达 肌肉组织的荧光免疫分析结果显示：与模型组比较，术后7、14 d，天麻醇提物组小鼠缺血侧下肢腓肠肌Tomato-Lectin、Ki67的阳性表达增多，见图2、图3。

图3 天麻醇提物对下肢缺血小鼠14 d新生血管的影响

2.3 qPCR检测结果

2.3.1 VEGF-A的表达情况 qPCR检测结果分析显示：与假手术组比较，术后1、14 d，模型组小鼠下肢缺血侧腓肠肌VEGF-A表达增加（P<0.05，P<0.001）；与模型组比较，术后1、3 d，天麻醇提物组小鼠下肢缺血侧腓肠肌VEGF-A表达增加（P<0.01，P<0.05），见表3。

表3 下肢缺血小鼠腓肠肌中VEGF-A mRNA的表达（±s，n=6）

表3 下肢缺血小鼠腓肠肌中VEGF-A mRNA的表达（±s，n=6）

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

时间 假手术组 模型组 天麻醇提物组1 d 1.00±0.00 1.63±0.56△ 3.55±1.15**3 d 1.00±0.00 1.15±0.31 2.38±1.25*7 d 1.00±0.00 0.85±0.41 2.00±1.20 14 d 1.00±0.00 1.93±0.41△△△ 1.97±0.64

2.3.2 VEGFR-2的表达情况 qPCR检测结果分析显示：与假手术组比较，术后14 d，模型组小鼠下肢缺血侧腓肠肌VEGFR-2表达增加（P<0.001）；与模型组比较，术后7 d，天麻醇提物组小鼠下肢缺血侧腓肠肌VEGFR-2表达增加（P<0.05），见表4。

2.3.3 Angpt2的表达情况 qPCR检测结果分析显示：与假手术组比较，术后 1、3、7、14 d，模型组小鼠下肢缺血侧腓肠肌Angpt2表达增加（P<0.05、P<0.01）；与模型组比较，术后 1、3、7 d，天麻醇提物组小鼠下肢缺血侧腓肠肌Angpt2表达增加（P<0.05、P<0.01），见表 5。

表4 下肢缺血小鼠缺血侧腓肠肌中VEGFR-2 mRNA的表达（±s，n=6）

表4 下肢缺血小鼠缺血侧腓肠肌中VEGFR-2 mRNA的表达（±s，n=6）

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

时间 假手术组 模型组 天麻醇提物组1 d 1.00±0.00 1.17±0.27 1.18±0.12 3 d 1.00±0.00 1.04±0.39 1.35±0.62 7 d 1.00±0.00 1.67±0.72 3.74±1.79*14 d 1.00±0.00 2.61±0.79△△△ 2.89±2.44

表5 下肢缺血小鼠缺血侧腓肠肌中Angpt2 mRNA的表达（±s，n=6）

表5 下肢缺血小鼠缺血侧腓肠肌中Angpt2 mRNA的表达（±s，n=6）

注：与假手术组相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

时间 假手术组 模型组 天麻醇提物组1d 1.00±0.00 2.55±0.99△△ 4.62±1.37*3d 1.00±0.00 2.86±1.33△△ 8.44±5.42**7d 1.00±0.00 4.08±2.41△ 17.14±13.60*14d 1.00±0.00 14.37±12.92△ 8.54±7.36

3 讨论

下肢缺血性疾病是常见的外周动脉疾病之一，主要原因是动脉狭窄或闭塞而引起下肢动脉的供氧量与需氧量之间不平衡所致[3]。临床主要表现为间歇性跛行、静息痛、溃疡及坏疽，严重者甚至可导致截肢或死亡。目前常见的治疗方法有外科手术、介入治疗、药物溶栓等，但均达不到良好的治疗效果[4-7]。近年来促血管新生技术的出现，使得在缺血部位重建侧肢循环，恢复有效血供逐渐成为可能，从而为缺血性疾病提供了新的治疗策略[8-10]。课题组前期实验结果表明，天麻醇提物能促进脑缺血后脑内血管新生，但其对外周缺血的作用未见报道，为进一步研究其是否具有促进外周缺血部位血管新生作用，本实验采用股动脉阻断法复制小鼠下肢缺血模型，该模型能够较好地模拟临床病人下肢缺血的病理状态，反应机体下肢严重缺血、供血不足的多个阶段，包括发生、演进和修复等过程[11]。给予天麻醇提物后，采用激光散斑扫描仪检测术后1、3、7、14 d的缺血侧下肢血流量，观察血流恢复情况，结果显示，术后3、7 d，缺血侧血流增加（P<0.001），提示天麻醇提物能促进下肢缺血小鼠的血流恢复；采用免疫荧光三标法，检测术后7、14 d的Ki67、Tomato-Lectin、DAPI的表达。Ki67是增殖细胞的标记物，Tomato-Lectin可以标记血管内皮细胞，DAPI标记细胞核，3个指标重合区域为新生血管。结果显示，术后7 d，Ki67/Tomato-Lectin的阳性表达明显，提示天麻醇提物可以促进模型动物缺血侧的血管新生。

血管新生是一个多信号介导、多细胞参与调控的过程。在缺血/缺氧情况下，缺氧诱导因子-1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）在组织缺血部位聚集，作为缺血情况的传感器，激活与缺血性损伤相关的血管新生过程[12]。其中VEGF-A/VEGFR-2信号通路参与调控血管新生的整个过程。在缺血早期VEGF-A和Angpt2大量表达，VEGF-A选择性的作用于内皮细胞膜上的酪氨酸受体VEGFR-2，使血管通透性增加并促进血管内皮细胞的增殖、迁移、出芽参与损伤部位的血管生成[13-15]，而血管生成素家族成员Angpt2在VEGF-A存在的条件下，能促进血管结构松解，消除血管基底膜和周细胞对内皮的支撑作用，使内皮容易浸润、迁移、黏附，增强了VEGF-A的促血管新生作用[16-19]。qPCR 检测术后 1、3、7、14 d 促血管新生因子的表达，实验结果表明，术后1、3 d，缺血侧VEGFA、Angpt2表达上调，术后7 d，VEGFR-2和Angpt2表达上调，提示天麻醇提物能促进模型动物下肢缺血是通过调节VEGF-A/VEGFR-2信号通路中促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-2、Angpt2 mRNA的表达而发挥作用的。

综上所述，天麻醇提物对小鼠下肢缺血模型具有促血管新生，增加缺血部位血流量，促进侧支循环建立的作用，其作用机制可能与促进促血管新生因子VEGF-A及其受体VEGFR-2、Angpt2的表达相关。