P2X3在偏头痛大鼠中脑的表达及正天丸作用机制研究*

白方会，李 慧，徐 茜，贾东佩，郭力硕，郭 跃，陈宝田，张保朝△

（1.南阳市中心医院，河南 南阳 473000；2.广州市红十字会医院，广东 广州 510220；3.南阳师范学院，河南 南阳 473000；4.南方医科大学，广东 广州 510515）

偏头痛以单侧头部反复发作的搏动性疼痛为特点。研究显示我国偏头痛女性年患病率较高（3.3%～32.6%）[1]。最新全球疾病负担调查显示偏头痛患病率攀升至全球第6位，为第2位全球高致残性疾病[2]。该病发病率高、治愈率低，目前缺乏安全有效的治疗措施。P2X3受体作为偏头痛的重要调节受体，本课题组前期就正天丸对P2X3受体在三叉神经血管系统表达的影响进行了研究[3-4]。中脑作为痛觉传导通路的关键部位，P2X3受体在此亦有表达。有研究报道在神经病理痛模型中P2X3受体在中脑内高表达起镇痛作用，与其在外周神经系统作用相反[5]。然而在中脑内P2X3受体活化是否介导偏头痛的发生尚不明确。本研究旨在探讨P2X3受体在偏头痛大鼠中脑内表达变化及正天丸的抗偏头痛作用是否影响了中脑P2X3受体的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠24只，平均周龄（10.1±1.3）周。由郑州大学实验动物中心提供，饲养条件：室内温度23～26℃，光暗周期12 h，相对湿度40%～60%，自由摄取食物和水，干预前适应性喂养7 d。动物实验遵循国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求[6]。正天丸（华润三九，批号：1710005H），硝酸甘油注射液（益民药业，批号：H11020289），荧光二抗-Cy3（凯基生物），P2X3 兔多克隆抗体（Santa Cruz），β-actin（中杉金桥），PVDF 膜（Millipore），ECL发光液和BCA试剂盒（碧云天），IS 2000 MM图像工作站（Kodak）。

1.2 偏头痛模型的建立 利用随机数字表法将大鼠随机分为空白组、偏头痛组、正天丸组，每组8只。正天丸组给予1.62 g/kg正天丸灌胃（药量依成人每日口服剂量进行换算）；其余两组给予生理盐水1 mL灌胃，连续给药7 d，末次灌胃30 min后大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油（10 mg/kg），制造偏头痛模型[7]，空白组皮下注射0.5 mL生理盐水。

1.3 行为学观察 以大鼠出现前肢频繁挠头、耳红、烦躁不安等视为造模成功[8]。观察指标：①大鼠造模后耳红出现和消失时间；②大鼠造模后挠头开始和结束时间，以大鼠出现连续5次以上挠头为挠头开始时间，以30 min内大鼠挠头次数不足5次且表现蜷缩不动状态为挠头结束时间。

1.4 机械痛阈值的测定 用Von Frey纤维丝评定大鼠疼痛阈值。正式实验前7 d，所有大鼠均行Von Frey纤维丝的适应性检测。进行实验时，先将大鼠置于测试装置内适应20 min，根据Dixon介绍的Up and Down法，用Von Frey纤维丝从2.0 g力度开始刺激大鼠须垫，以纤维丝弯曲成C型，刺激1～2 s，阳性反应为大鼠缩头、用爪拨开纤维丝和发声等逃离反应行为。当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应，则给予相邻小一级力度的刺激，当出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定5次，取其阳性数值的平均值即为疼痛阈值。检测时间点为造模前0.5 h、造模后0.5 h、造模后 1.5 h、造模后 2.5 h。

1.5 标本采集与指标检测

1.5.1 免疫荧光检测 造模4 h后，10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，开颅取大脑，4%多聚甲醛固定24 h，脱水、石蜡包埋切片，片厚约10 μm。切片依次进行脱蜡、水化、热抗原修复和灭活内源性过氧化物酶后，BSA封闭后加入P2X3一抗（1∶500），4 ℃过夜，滴加 Cy3荧光二抗（1∶500），避光孵育1 h，倒置显微镜下观察结果，显现红色为P2X3受体阳性，对照组以PBS作一抗。

1.5.2 Western blot检测 造模4 h后各组取4只大鼠，麻醉后迅速冰上取材，裂解组织，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h，TBST冲洗3次，加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，羊抗兔二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，采用ECL化学发光法进行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0（Kodak）软件分析条带灰度值，每组重复检测3次，以β-actin为内参。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验或单因素方差分析，方差不齐时用Welch近似方差分析，组间多重比较，方差齐时用SNK-q检验，不齐时用Dunnett’s T3法，组内比较用配对t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学表现 偏头痛组和正天丸组大鼠造模后均出现耳红、频繁挠头及爬笼等表现，空白组大鼠表现不明显，提示造模成功。2组大鼠耳红出现时间和挠头开始时间比较均无差异，均在造模后4 min左右开始；正天丸组耳红持续时间和挠头持续时间均较偏头痛组缩短30 min左右（P<0.001），见表 1。

表1 各组大鼠耳红及挠头时间比较（±s，n=5，min）

表1 各组大鼠耳红及挠头时间比较（±s，n=5，min）

注：与偏头痛组相比，*P<0.001

组别 只数 耳红出现时间 耳红消失时间 挠头开始时间 挠头结束时间偏头痛组 5 4.08±0.79 134.92±7.25 4.42±1.08 136.50±5.96正天丸组 5 3.92±0.90 100.58±7.37* 4.17±0.83 101.17±5.41*t值 0.48 11.50 0.63 15.21 P值 0.64 0.000 0.53 0.000

2.2 各组大鼠疼痛阈值的变化 结果显示，造模前各组大鼠基础疼痛阈值无明显差异，空白组除造模后0.5 h较造模前稍降低外（P=0.046），其余各时间点较造模前均无显著差异；偏头痛组各时间点疼痛阈值较造模前及同期空白组均明显下降，再次证实已经成功复制了偏头痛模型；正天丸组造模后0.5 h疼痛阈值明显下降，但随后呈持续回升趋势，造模后 1.5 h疼痛阈值（16.05±5.45）与空白组（31.72±9.72）相比差异无统计学意义。各组大鼠疼痛阈值比较见图1。

图1 各组大鼠疼痛阈值变化

2.3 P2X3受体在中脑内的定位表达情况 免疫荧光结果显示，P2X3受体在中脑内多数神经核团均有阳性表达，本文选取了具有典型定位意义的中脑导水管周围的神经核团。从图2中可知，偏头痛组呈明显高表达状态（图中高亮的红色荧光颗粒），正天丸组表达强度较偏头痛组降低，空白组可见少量阳性表达。

2.4 中脑内 P2X3受体蛋白表达情况 Western blot结果显示，P2X3/β-actin比值整体组间比较有显著差异（F=178.51，P=0.000），组间两两比较显示，3组之间均存在显著差异（P=0.000），偏头痛组（0.87±0.04），P2X3蛋白表达显著高于其它2组，正天丸组（0.63±0.06）高于空白组（0.25±0.01），见图 3。

3 讨论

偏头痛属于中医学“头风”“头痛”“首风”“脑风”“偏头风”等范畴。偏头痛多为本虚标实之证，病位在脑髓经络，与肝、脾、肾三脏密切相关[9]。风、瘀、湿、虚为偏头痛的主要致病因素[10-12]。正天丸是全国名老中医陈宝田教授创制的中成药复合组方，由头痛四大古方：川芎茶调散、麻黄附子细辛汤、桃红四物汤、四藤消震饮化裁而来。正天丸综合各方之精华，具有疏风活血、通络止痛、养血平肝等功效，为临床治疗偏头痛的国家基本药物，以其显著的疗效受到患者及医务工作者的好评，并远销海外。本研究中通过对大鼠行为学观察可知，成功复制了偏头痛动物模型，而正天丸可以明显缩短大鼠偏头痛样行为的持续时间，通过对大鼠面部疼痛阈值的测定双重验证了正天丸有明显镇痛作用。

图2 各组大鼠中脑内P2X3的表达（×100）

图3 各组大鼠中脑P2X3受体蛋白的表达

P2X3受体属于嘌呤能受体，介导痛觉过敏的形成与维持，参与了炎性痛、神经病理性痛、癌痛、偏头痛等多种急慢性疼痛的形成过程，目前已成为疼痛治疗领域的新靶点[13-15]。

用于镇痛的P2X3受体第二代拮抗剂已进入到临床前研究阶段[16]。P2X3受体选择性高表达于处理痛觉信息的感觉神经元上[17-18]。

中脑作为中枢内源性疼痛调节系统的关键部位，P2X3受体也参与了中脑的疼痛调节过程，P2X3受体在正常大鼠中脑内有少量分布[19]。有学者报道，在慢性坐骨神经结扎所致神经病理痛模型中P2X3受体在中脑内高表达起到镇痛作用，不同于其在外周神经系统的致痛作用[5]。神经病理痛是由于神经系统（传入神经、脊髓或中枢神经系统等）功能异常或结构损伤所致的疼痛[20-21]，其发病机制与偏头痛有所不同。那么在偏头痛大鼠中脑内P2X3受体起何作用，与本课题组前期研究结果，其在偏头痛大鼠三叉神经血管系统高表达介导偏头痛发生的作用是否一致？

本研究在正常大鼠中脑发现少数P2X3免疫阳性神经元细胞，主要位于PAG外侧区，与文献报道一致，说明在生理状态下中脑内有少量P2X3受体表达。通过免疫荧光和western blot的双重验证，结果显示偏头痛组大鼠中脑内P2X3受体表达明显升高，正天丸组P2X3受体表达较偏头痛组明显降低，证明中脑内P2X3受体的活化介导了偏头痛的痛觉信息传递，与其在三叉神经节、脊神经节等周围神经系统所起作用一致。正天丸的抗偏头痛作用与其可以抑制外周及中枢（中脑）神经系统内P2X3受体过表达有关，为其临床疗效奠定了有力的客观依据。