基于UPLC-Q-TOF MS技术的血栓心脉宁片成分分析

谭 静，林红强，刘云鹤，王 涵，吴福林，董庆海，赵 莹，李平亚，刘金平，郝秀华,3

(1.吉林大学药学院天然药物研究中心，吉林 长春 130021； 2.吉林大学再生医学科学研究所生化研究室，吉林 长春 130021；3.吉林大学药学院药物制剂教研室，吉林 长春 130021)

血栓心脉宁片(XXT)为中国药典(2015年版)收载品种，其处方组成包括丹参、川芎、槐花、人参茎叶总皂苷、毛冬青、水蛭、人工牛黄、人工麝香、冰片和蟾酥等10味中药，具有芳香开窍、活血散瘀之功效[1-3]，临床上主要用于脑血栓、冠心病、心绞痛属血瘀证者[4]。研究表明[3,5-6]，XXT抗血瘀的作用靶点很多，包括下调F13a1、Car1和Tbxa2r等基因以改善血流状态，上调Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信号通路的蛋白表达以抗血管内皮细胞氧化损伤，调控类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢和脂类代谢等内源性代谢物通路以治疗血瘀等。目前，XXT的化学成分研究主要集中于指纹图谱的建立及含量测定等方面[7-8]。2015版药典分别对XXT中的阿魏酸、芦丁和丹酚酸B等5种成分进行了含量测定[1]；明磊等[9]运用UPLC-ESI-MS/MS和GC-MS技术从XXT中共鉴定出丹参酮类、人参皂苷类及蟾酥甾二烯类等47种非挥发性成分和龙脑、异龙脑等36种挥发性成分。但XXT的药效物质基础研究稍显薄弱，许多成分尚未明确。

超高效液相色谱-飞行时间质谱 (UPLC-Q-TOF MSE) 联用技术以其快速、灵敏、高分辨的优势，不仅适用于多组分快速检测，还能够对复杂基质中的组分准确定性。UNIFI天然产物分析平台提供的数据库包括从600多种中药中发现的6 000多种化合物信息，该平台能够将数据采集、峰提取、分子式确定、数据库检索以及生成报告相结合，可对化学成分进行快速、全面地定性分析。目前，已有较多文献[10-17]报道将UPLC-Q-TOF MS与UNIFI平台结合用于传统中药及复方中药化学成分鉴定。但尚未见采用该方法对XXT的化学成分进行研究的报道。

本研究拟采用UPLC-Q-TOF MS 结合UNIFI平台，对该复方制剂开展小分子化学成分(100～1 500 u)的快速、全面分析与鉴定，以全面了解该中药大品种的化学组成。希望为阐明XXT的药效物质基础和提升质量控制标准提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器与装置

Xevo G2-XS型Q-TOF四极杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC二元泵和样品管理器、UNIFI科学信息学系统V1.7：美国Waters公司产品；TGL-16aR型飞鸽超离速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；FA-N/JA-N型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司产品；RE 52CS型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂产品。

1.2 材料与试剂

血栓心脉宁片(批号分别为：180103、180404和180605)：吉林华康药业股份有限公司产品；甲酸钠、乙腈：UPLC-MS级，美国Fisher公司产品；亮氨酸-脑啡肽：美国Sigma公司产品；纯净水：购自广州屈臣氏食品饮料有限公司；胆红素、齐墩果酸、丹参酮IIA、二氢丹参酮Ⅰ、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、芦丁、槲皮素、腺苷、山柰酚、咖啡酸、脂蟾毒配基、丹参酮Ⅰ、猪去氧胆酸、胆酸、华蟾酥毒基、绿原酸对照品：购自中国药品生物制品检定所；染料木素、金丝桃苷和隐丹参酮：购自四川省维克奇生物科技有限公司；丹酚酸B、丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛：购自北京普天同创生物科技有限公司。

2 实验部分

2.1 样品及对照品溶液的制备

取90片(每批次随机取30片)血栓心脉宁片，研细，混合均匀，精密称取5.0 g粉末，加50 mL 70%甲醇，回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至干，加甲醇溶解并定容至5 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，备用。

精密称取适量丹参酮IIA、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、芦丁、脂蟾毒配基、丹参酮Ⅰ、胆酸、华蟾酥毒基、绿原酸、隐丹参酮和丹酚酸B等对照品，加入适量甲醇，超声溶解，并定容至10 mL，于4 ℃避光保存，备用。

2.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱温30 ℃；样品管理器温度15 ℃；进样体积5 μL；流速0.4 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液， B为0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～2 min(10%B)，2～26 min(10%～90%B)，26～28 min(90%B)，28～28.1 min(90%～10%B)，28.1～30 min(10%B)。

2.3 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，MSEcontinuum模式，正离子及负离子检测模式；质量扫描范围m/z50～1 500；优化的仪器参数如下：ESI+和ESI-模式下，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压40 V，锥孔气流量50 L/h，脱溶剂氮气流量600 L/h，氩气流量0.15 mL/min，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度300 ℃，低能通道中碰撞能量设置为6 V，高能通道设置为20～40 V。亮氨酸-脑啡肽m/z556.277 1[M+H]+，m/z554.262 0[M-H]-作为Lock Spray实时校正标准液(100 ng/L)，流速15 μL/min，以甲酸钠溶液对质量数进行校正。

2.4 数据处理

首先，通过查阅文献汇总文献中的化合物结构式，建立XXT数据库，作为UNIFI分析平台自带数据库的补充，并将自建数据库导入分析方法；第二，将LC-MS原始数据以Waters Compression and Archival Tool v1.10软件进行压缩；第三，通过UNIFI处理平台对数据进行自动筛查与鉴定；第四，筛选质量误差为±5 mu，且响应值大于3 000的成分；最后，根据碎片离子精确质量数、相对保留时间和分子式、元素分析、离线及在线质谱数据库(PubMed、Chemspider、Mass Bank、METLIN)、对照品比对以及查阅相关文献，对各主要化合物进行人工识别和鉴定。

3 结果与讨论

MSE数据采集模式可同时进行母离子、子离子、中性缺失分析，通过快速切换低碰撞能和高碰撞能扫描，同时完成两种扫描功能的数据采集，排除假阳性结果。低碰撞能扫描可得到相关分子离子峰及加合离子峰信息；高碰撞能扫描可得到相关碎片峰信息[18]，可为定性分析提供较多的结构信息，实现一次性快速分析多个复杂成分。

本实验以指纹图谱共有峰的个数及强度为指标，考察了 30%、70%、100%甲醇作为提取剂对样品的提取效果[19]。结果表明，70%甲醇提取物中色谱峰最多，峰强度较大，表明其对各类型成分均具有较好的提取效果，故选择70%甲醇为提取溶剂。

本研究共鉴定了187种化学成分，包括三萜皂苷、菲醌、蟾蜍甾二烯类、甾体及其他结构类型的化合物。其中，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rd等33种成分是通过比对对照品的保留时间、一级质谱及二级质谱中碎片离子信息进行鉴定。其余成分是通过精确分子质量，并结合文献报道的特征质谱信息进行鉴定。正、负离子模式下的基峰离子流图示于图1。各保留时间、分子、准分子离子峰实测值及理论值、质量误差、主要碎片离子和来源信息列于附表1，其结构示于附图1～9(附表和附图请登录《质谱学报》官网下载)。

3.1 XXT中三萜皂苷类成分分析

从XXT中共鉴定了46种三萜皂苷类成分。以四环三萜类化合物90为例，在ESI-模式下，高能通道质谱图和裂解碎片示于图2a(详细裂解碎片列于附表1)，其准分子离子峰为m/z1 123.594 0[M+HCOO]-，碎片离子m/z459.354 7是原人参二醇皂苷元的特征离子，主要碎片离子m/z915.532 6是由母离子峰丢失1分子葡萄糖残基(162 u)产生，继而丢失1分子阿拉伯糖残基(132 u)及甲基形成碎片离子m/z765.439 6；m/z621.434 3由母离子脱去1分子阿拉伯糖残基和2分子葡萄糖残基产生，继而丢失1分子葡萄糖残基形成碎片离子m/z459.354 7，这与文献[20]报道基本一致。由此推测，化合物90为人参皂苷Rc。

五环三萜类化合物114的高能质谱图和裂解碎片示于图2b。准分子离子峰为m/z765.445 6[M-H]-，碎片离子m/z601.387 5是由母离子丢失1分子葡萄糖残基产生，继而丢失1分子木糖残基及甲基形成m/z455.312 2，与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物114为毛冬青皂苷B1。

图1 正(a)、负(b)离子模式下，血栓心脉宁片的基峰离子流图Fig.1 Chromatograms of XXT in ESI+ (a) and ESI- (b) mode

图2 ESI-模式下，化合物90(a)和化合物114(b)的高能质谱图Fig.2 High-energy mass spectra of compound 90 (a) and compound 114 (b) in ESI- mode

3.2 XXT中菲醌类成分分析

从XXT中鉴定了30种菲醌类化合物，其母核多为邻菲醌和对菲醌，易失去CHO、CH3、H2O及CO等基团。以化合物161为例，准分子离子峰为m/z297.174 6[M+H]+，在ESI+模式下，高能质谱图和裂解碎片示于图3。m/z282. 122 9、269.156 8是其特征离子峰，与丹参酮IIA碎片离子特征相似，碎片离子m/z282.122 9、269.156 8和239.110 8分别为母离子丢失CH3、CH2O、C3H6O产生；m/z269.156 8和239.110 8继而分别丢失1分子C5H10、CH3产生碎片离子m/z199.073 5和225.089 8，这与文献[22]报道基本一致，据此可推断化合物161为隐丹参酮。

3.3 XXT中蟾蜍甾二烯类成分分析

从XXT中鉴定了25种蟾蜍甾二烯类成分，该类成分多羟基，C-17侧链为Δα β，γ δ-δ内酯，质谱裂解较易脱去H2O和m/z96、109、123、135、136等含有δ-吡喃环的碎片，其中δ-吡喃环较易丢失CO形成δ-呋喃环。以化合物118为例，准分子离子峰为m/z443.242 5[M+H]+。在ESI+模式下，其高能质谱图和裂解碎片示于图4。m/z401.215 2是通过酯键断裂丢失C2H3O产生，继而脱去δ-吡喃环(96 u)(—C5H3O2)形成m/z287.167 2；母离子脱去CO和H2O产生m/z393.202 7，脱去1分子H2O和侧链C2H3O2形成m/z365.210 6，m/z261.182 8由母离子丢失含δ-吡喃环的碎片C9H8O4产生。通过与对照品比对，可推断化合物118为华蟾酥毒基。

图3 ESI+模式下，化合物161的高能质谱图Fig.3 High-energy mass spectrum of compound 161 in ESI+ mode

3.4 XXT中甾体类成分分析

鉴定了18种甾体类成分，均以环戊烷骈多氢菲为母核，较易脱去C-3位羟基和C-17位侧链和羧基。以化合物121为例，其保留时间为12.47 min，准分子离子峰为m/z407.281 2[M-H]-，m/z327.251 3是其特征离子峰。在ESI-模式下，其高能通道质谱图示于图5。质谱图中出现了碎片离子m/z353.247 7[M-H-3H2O]-、m/z343.264 0[M-H-H2O-HCOOH]-、m/z327.251 3[M-H-2H2O-HCOOH]-、m/z289.217 5[M-H-2H2O-C5H9O2]-，这与对照品的保留时间、碎片离子信息基本一致，结合文献[23]鉴定化合物121为胆酸。

3.5 XXT中其他类成分分析

应用提取离子色谱法结合UNIFI平台，共推断出68种其他类化合物，包括苯丙酸、黄酮、生物碱及内酯类等成分。各化合物准分子离子峰的精确质量数均在±5 mu误差范围内，具体质谱数据列于附表1。以化合物40为例，其保留时间为6.96 min，准分子离子峰为m/z717.147 3[M-H]-。在ESI-模式下，其高能质谱图和裂解碎片示于图6。m/z519.092 9是其特征离子峰，由母离子丢失C9H9O5产生，m/z519.092 9继而丢失1分子羧基形成碎片离子m/z473.086 0；m/z519.092 9断裂酯键分别丢失C9H9O4、C9H9O5产生m/z339.050 5、321.040 0，m/z321.040 0继而丢失CO产生m/z293.045 0，这与对照品的保留时间及碎片离子信息基本一致，结合文献[24]推断化合物40为丹酚酸B。

图4 ESI+模式下，化合物118的高能质谱图Fig.4 High-energy mass spectrum of compound 118 in ESI+ mode

图5 ESI-模式下，化合物121的高能质谱图Fig.5 High-energy mass spectrum of compound 121 in ESI- mode

图6 ESI-模式下，化合物40的高能质谱图Fig.6 High-energy mass spectrum of compound 40 in ESI- mode

4 结论

本研究将UPLC-Q-TOF MS与UNIFI天然产物分析平台相结合，用于分析血栓心脉宁片化学成分。通过比对各成分对照品的精确分子质量、保留时间及质谱碎片离子信息，并借助文献报道，从XXT中共鉴定了三萜皂苷、菲醌、蟾蜍甾二烯及甾体等多种结构类型共187种化学成分。结果表明，该复方制剂中化学成分丰富、结构多样，为全面了解血栓心脉宁片的化学组成提供了数据支持，同时，化学成分的结构多样性可为阐明其作用靶点多样性奠定物质基础。由于对照品和文献报道有限，仍有一些未鉴定的成分，在后续工作中有待进一步分离与鉴定，同时对各成分与各作用靶点进行关联性研究。