中长期慢性脑低灌注海马CA1区神经元凋亡及加减薯蓣丸干预作用的实验研究

目前我国血管性痴呆(vascular dementia，VD)发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)[1]，约占痴呆的20%，是第二大痴呆的原因。血管性痴呆及混合性痴呆等老年性痴呆早期阶段发生的慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)导致神经变性及神经元凋亡，在痴呆发生中发挥重要作用[2]。双侧颈总动脉阻断(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)可导致CCH[3]。业已证实：BCCAO后脑血流下降，7 d后，海马并没有减小，但CA1区神经元的密度明显下降[4]，2周后神经元丢失并导致认知功能损害。可见CCH在短期内即可导致海马神经元丢失。临床上多数病人CCH状态难以纠正，中长期CCH条件下对海马神经元凋亡及炎症影响研究不多。基于《金匮要略》薯蓣丸原方，融秘方益智灵[5]于一体化裁而来的加减薯蓣丸(modified Shuyu pills，MSP)，由山药、熟地黄、杜仲、首乌、炙远志、茯苓等14味中药组成，具有补肾填精、健脾益气的功效。临床上长期服用可有效改善非痴呆型血管性认知功能障碍[6]。本实验观察中长期CCH大鼠海马CA1区Bax、Bcl-2、核转录因子(NF-κB)表达、病理学改变及MSP的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠40只，体重(300±20)g，8～9周龄，购自湖北省预防医学科学院实验动物中心[许可证号：SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠喂养于湖北中医药大学针灸研究所动物房，光照/黑暗时间为14 h/10 h，温度控制在(24±2)℃，湿度保持在(50±10)%，进食及饮水自由。

1.2 造模方法 采用改良BCCAO方法制作CCH模型。适应性喂养1周后，大鼠按照随机数字表分为手术组(28只)及假手术组(12只)。手术组采用异氟烷吸入麻醉，分次结扎双侧颈总动脉方法造模。即先分离右侧颈总动脉并两端结扎，从结扎中心剪断颈总动脉，后缝合皮肤并以青霉素4 000 U局部滴注预防感染；1周后以同样方法处理左侧颈总动脉。假手术组不结扎及剪断颈总动脉，其余步骤同手术组。

1.3 干预措施 造模后，假手术组死亡1只，手术组死亡5只。双侧颈总动脉结扎术后1周开始灌胃。将手术组按随机数字表分为药物组(12只)、模型组(11只)。药物组以加减薯蓣丸提取物(湖北省中医院制剂室提供，经提纯，浓缩为每毫升含药材1 g)灌胃，按照10 g/(kg·d)剂量，共灌胃45 d；模型组及假手术组用生理盐水灌胃，剂量、疗程及方法同药物组。

1.4 水迷宫实验 共进行5 d，前4 d为定位航行实验，最后1 d为空间搜索实验。水迷宫实验采用成都泰盟科技公司的设备及软件进行检查。定位航行实验每天进行两次，从4个不同象限中将大鼠面向池壁放入水中。计算机自动计算每个大鼠的航行距离及逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内找不到水下的平台，则引导其到平台并停留2 min，使其记忆平台与周围环境的关系，逃避潜伏期记为120 s。其余则按照实际时间和距离由计算机测算。最后1 d则撤除平台，计算大鼠在120 s搜索过程中的跨越平台次数，平台所在象限(第一象限)游行时间及距离，总的游行距离。

1.5 动物取脑 各组8只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉(0.35 g/kg)，将其固定于解剖板上，剖开腹腔，暴露肝脏和横膈膜，迅速剪开横膈膜，打开胸腔，暴露心脏。将灌注针头从心尖部位经左心室插入升主动脉，剪开右心耳，快速灌入生理盐水100～150 mL，直至体循环血液冲洗干净，流出清亮灌流液，待大鼠尾巴伸直，四肢颤抖停止时，观察肝脏逐渐变成白色；再用4%多聚甲醛灌注(250 mL左右)，40 min左右断头取脑，分离出海马组织，固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12～24 h，行常规脱水、浸蜡、包埋、苏木素伊红(HE)染色及免疫组化染色。

1.6 免疫组化分析 制备海马石蜡切片，经过抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、添加一抗(分别为小鼠anti-Bax，anti-Bcl-2及anti-NF-κB)、加辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体、滴加新鲜配制的DAB显色液及Harris苏木素复染。采集图像，使用IPP6.0软件对免疫组化照片进行光密度分析，每张切片选取3张400倍照片做光密度分析，以平均光密度进行比较分析。

2 结 果

2.1 水迷宫实验结果 水迷宫实验中，各组逃避潜伏期在第1天、第2天比较差异无统计学意义；第3天开始，假手术组逃避潜伏期与模型组相比明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；第4天药物组逃避潜伏期下降较快，与假手术组接近，药物组、假手术组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。在空间搜索实验中，假手术组及药物组跨越平台次数多于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，平台所在象限游行时间及游行距离长于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；3组总游行距离及速度比较差异无统计学意义，详见表2。

表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行逃避潜伏期比较(±s) s

与模型组同时间相比，1)P<0.05

表2 各组大鼠Morris水迷宫空间搜索实验结果比较(±s)

与模型组相比，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 海马CA1区病理学结果 假手术组海马CA1区锥体细胞排列3～5层，层次分明，相邻细胞排列整齐致密，细胞质均质红染，胞核大而圆，核仁清晰；模型组海马CA1 区细胞数目减少，细胞排列紊乱稀疏，椎体细胞分1～3层，细胞形态不完整，胞浆内可见空泡，细胞核深染、固缩，呈三角形或不规则形，核仁不明显，部分细胞核消失；药物组海马CA1 区神经元排列较为整齐，椎体细胞明显增多，排列5～7层，结构相对正常。详见图1。

假手术组 模型组 药物组

2.3 海马CA1区免疫组化结果 Bax表达：模型组最高，与药物组及假手术组相比差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组最低，与药物组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Bcl-2：药物组表达最高，与假手术组及模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组Bcl-2表达比模型组高，差异有统计学意义(P<0.01)。NF-κB：药物组和假手术组均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，药物组高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠海马Bax、Bcl-2及NF-κB蛋白表达平均光密度值比较(±s)

与模型组相比，1)P<0.01；与假手术组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨 论

海马是学习记忆的重要中枢，短暂性脑缺血可导致选择性神经元死亡[7]，死亡率最高的是海马CA1区的神经元，可见海马神经元对急性缺血异常敏感。与人类一样，大鼠有一套完整的连接颈动脉系统和椎动脉系统的Willis环。在双侧颈总动脉结扎手术后，虽然双侧颈动脉被结扎，椎动脉可通过Willis环代偿，向颈动脉供血区域提供血液。因此，双侧颈总动脉结扎导致大鼠全脑的低灌注，而不会造成中风[8]。经多普勒血流测定：成功的双侧颈总动脉结扎可使大脑血流下降70%[9]。本实验中通过改良BCCAO法分次结扎颈总动脉，有利于观察中长期CCH海马组织学改变。

水迷宫实验中，模型组定位航行和空间搜索实验均展现出学习记忆的障碍，与假手术组比较差异有统计学意义。药物组较模型组明显改善，表明MSP能改善中长期CCH大鼠的学习记忆功能。从病理学检测进一步证实：模型组海马CA1区神经元明显丢失、胞浆空泡化、细胞器溶解及细胞核固缩、消失等改变，考虑与神经元凋亡相关。药物组较好保持了神经元正常结构且神经元明显再生，表明MSP对中长期CCH大鼠海马具有保护缺血神经元，维持正常神经结构并促进神经元再生的作用。进一步的免疫组化检测中，假手术组Bax表达最低，模型组最高，药物组较模型组明显降低，表明中长期CCH大鼠仍然有神经元凋亡发生而MSP具有抗凋亡的作用；从Bcl-2表达来看：药物组较模型组明显升高，表明MSP能促进中长期CCH大鼠海马CA1区Bcl-2表达，进一步发挥抗凋亡的作用；从NF-κB表达来看，假手术组最低，模型组最高，药物组较模型组明显较低，表明中长期CCH大鼠海马仍有明显神经炎症，而MSP能抑制NF-κB表达而调节局部炎症状态。

在脑缺血情况下，海马CA1区的椎体神经元可自发性再生[10]。从本实验中可看出，模型组椎体神经元在中长期CCH条件下继续有神经元凋亡和丢失，因此再生的神经元在功能上仍难以代偿受损的神经组织而导致认知功能障碍难以恢复。而MSP有效的对抗凋亡，再生的神经元可有效促进认知功能恢复。研究表明：脑局部缺血后，持续的炎症能增加脑损伤程度，比初期的炎症更有害[11]，NF-κB激活可使肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放达到极限[12]，导致明显的神经炎症并促进神经元凋亡，抑制星型胶质细胞NF-κB激活可发挥抗凋亡的作用。从本实验中可看出中长期的CCH可诱导明显的炎症并对凋亡有明显的促进作用，而MSP则能抑制炎症而进一步抗凋亡。

神经元凋亡伴随着VD发展，抗凋亡对于VD的恢复至关重要[13]。既往研究证实：MSP能明显促进VD大鼠海马脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)mRNA表达[14]。BDNF能激活细胞内PI3K/Akt信号通路，PI3K/Akt信号通路调节生长、存活及代谢[15-16]。激活的Akt通过调节下游的靶分子如Bcl-2 和Bax来抑制凋亡，维持细胞存活[17]。MSP对于中长期CCH海马可能通过促进BDNF表达来发挥抗凋亡，保护神经组织固有构造从而预防痴呆的发生。

目前认为肾虚脑消髓减为VD的重要病机。本方以山药、熟地、首乌、杜仲等补肾益气、填精生髓；并以党参、白术、茯苓、山药益气健脾，补后天之本而强先天之本，以图精充髓足而脑神灵敏自用。结合本研究可以看出，精髓实质相当于神经元、突触等精微构造。因此，MSP填精益髓实质在于抗缺血条件下的神经元凋亡与促进神经再生，从而改善痴呆大鼠的认知功能可能是其取得临床良效的重要机制之一。