不同心血管危险分层高血压患者肠道菌群多样性分析

陈维玉 陈扬平， 冯婷 胡兴卫 周风云路祥麒 张秋霞 张新禄 陈鹏 修建成

南方医科大学南方医院1心血管内科，2科研处（广州510515）；3南方医科大学基础医学院病生教研室（广州510515）

高血压是最常见的慢性非传染性疾病，也是心脑血管疾病最主要的危险因素之一［1］。据世界卫生组织统计，全球范围内高血压患者超过10 亿。而且，随着人口老龄化的发展，预计到2025年全球高血压患病人数将上升至15 亿［2］。高血压是多因素共同作用、相互叠加的结果，尤其是遗传因素和环境因素［3-4］，其发病机制尚未明确。近年来，肠道微生物改变宿主健康状况的潜在作用引起了国内外研究人员的关注。越来越多的证据表明肠道微生态失调与高血压密切相关［5］，16S rDNA 高通量测序技术分析发现高血压动物和高血压人群均存在肠道微生态的失调［6］。LI 等［7］对高血压前期及高血压患者进行了宏基因组测序，并将高血压患者粪便移植到无菌小鼠体内，其结果证实了异常肠道微生物在高血压发病机制中的作用，并强调了早期干预对高血压前期的意义。有趣的是，高血压的分级与患者富集的基因关联群组（metagenomic linkage groups，MLG）的丰度呈正相关，而与健康组富集的MLG 丰度呈负相关，表明微生物相对丰度可能是高血压发展的潜在风险因素［8］。

高血压是一种多病因相互作用导致的复杂性进行性心血管综合征，血压数值只是高血压的一项生物指标，并不能决定其预后。临床实践中将高血压人群的心血管风险分为低危、中危、高危和很高危。研究证实，心血管危险分层对各种心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）事件发生（心肌梗死、心血管死亡率、总死亡率及主要心血管事件）具有非常好的预测价值［9］。因此，本研究拟探索不同心血管危险分层高血压患者肠道菌群组成及丰度的变化，以进一步揭示高血压疾病进展的相关机制，为降低高血压心血管事件的发生风险提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究共入组85 例原发性高血压患者，根据2018 欧洲高血压指南［10］将患者分为高血压低中危组（LI 组）、高危组（H 组）及很高危组（VH组），所有个体均来自南方医科大学南方医院心血管内科。排除标准：（1）患者＜18 岁；（2）患有肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、呼吸道感染等疾病；（3）2 个月内接受过抗生素或益生菌治疗。该研究通过了南方医科大学南方医院伦理委员会关于开展临床研究的审批，充分告知入组病人并获签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 患者资料收集患者的资料分为基本资料和临床资料。基本资料包括：姓名、性别、年龄、身高、体质量、BMI、吸烟、心功能、既往病史（高血压、冠心病、糖尿病、慢性肺病、心外动脉疾病等）。临床检查资料包括：患者血压、生化及检查指标。患者的血压以患者入院时测量的肱动脉压为准，测量方法符合《中国血压测量指南》的标准。生化指标通过患者入院抽血检查中获得，包括血糖、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血清肌酐等；检查指标包括：心脏射血分数、肺动脉压等。

1.2.2 患者心血管危险因素分层根据2018年欧洲高血压指南［10］，将患者分为高血压低中危组、高危组、很高危组3 组。其中，Score 评分是评估高血压患者10年心血管事件发生风险的重要指标，使用在线网站（http：//www.euroscore.org/calc.html）计算各患者Score 评分，按照2018 欧洲高血压指南将Score 评分≥10%，或重度慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）、伴有靶器官损害的糖尿病、达到50%以上的血管狭窄、或发生临床心血管疾病（包括ACS、卒中等）评为很高危；Score 评分5% ～10%，或单个危险因素（尤其是胆固醇）显著升高、3 级高血压、无靶器官损害的糖尿病患者、高血压伴左室肥厚、中度CKD 为高危；Score 评分1% ～5%，或2 级高血压为中危；10年Score 评分＜1%为低危。

1.2.3 样品采集和DNA 提取收集患者的新鲜粪便样本，20 min 内置于液氮罐中运送至实验室于-80 ℃保存。称取粪便样品20～50 mg，加PBS和0.5% Tween-20 混 匀 进 行-80 ℃10 min 和60 ℃5 min 反复冻融3 次，用蛋白酶K、RNA 裂解酶和10% SDS 于55 ℃金属浴中裂解粪便样品，离心取上清，加入酚、氯仿、NaoAC 和异丙醇抽提菌液DNA，并用75% 乙醇洗涤沉淀，最后将DNA 样品溶解于双蒸水中。采用Qubit 对DNA 浓度进行定量，并通过Agilent 2100 评价DNA 完整性，将DNA质量合格的样本用于文库构建。

1.2.4 文库构建采用二步PCR 方法构建样本文库，以不同样本DNA为模板，通过PCR反应完成第一轮扩增，采用磁珠法纯化PCR 产物，然后用含有不同index 的引物进行第二轮PCR 扩增，再经磁珠纯化后，应用Qubit 和Agilent 2100 检测文库质量。最后采用Illumina Hiseq测序平台对样品进行测序。

1.2.5 16S rDNA 高通量测序采用Illumina HiSeq 测序仪进行高通量测序。文库制备完成后，簇生成和测序都在HiSeq 上完成。对提取的DNA 样本进行16S rDNA V3V4 区基因扩增及测序，扩增引物为5′-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和5′-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′。对各样品进行PCR 扩增和总体测序分析。

1.2.6 数据分析测序得到的原始数据经过质量控制测序接头序列、低质量序列和低复杂度序列，利用重叠关系进行序列拼接。应用Usearch 10.0软件在97%相似度下聚类得到操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）并去除嵌合体序列。基于Greengene 数据库对OTU 代表序列进行比对和物种注释。基于每个注释物种得到的reads 丰度，利用Kruskal-Wallis 方法计算3 组患者物种注释上的丰度差异情况。使用Qiime 1.9.0 软件基于OTU 的分析结果，抽取一组N 条reads（N 小于reads 总数M），进行样品微生物α多样性分析，通过α 多样性分析能够了解样品中微生物多样性程度，多样性指数包含Observes species、Shannon 指数等，并根据分析结果做出稀释曲线。使用Qiime 1.9.0 软件，汇总不同样本中属于相同物种的reads数据，计算样本间距离矩阵，得到的矩阵用于PCoA 可视化进行样品微生物β多样性分析。

1.3 统计学方法用R 3.5.2 软件进行统计分析。计量资料呈正态分布且使用均数±标准差来表示，其他使用中位数（四分位数）表示，计数资料用率来表示。使用One way ANOVA 进行两组以上正态分布资料的检验，其他使用kruskal-wallis H 检验统计计量资料；计数资料比较用R×C 格表χ2检验或校正χ2检验或确切概率检验。spearman 相关分析用来评价肠道菌群与Score 评分相关性。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压不同危险分层患者肠道微生物的组成和多样性分析本项目共入组85 例原发性高血压患者，根据2018 欧洲高血压指南进一步分为高血压低中危组、高危组和很高危组。3 组患者的人口学及临床资料特征见表1。结果显示，除血压、年龄、血清肌酐和临床并发症外其余指标的组间比较差异无统计学意义（P＜0.05）。

为研究不同心血管危险分层高血压患者的肠道菌群组成，本项目对粪便样品进行了16S rDNA高通量测序，获得了3 860 470 条高质量序列（平均每个样品45 417 条）。α多样性分析结果发现随着高血压危险分层的升高，患者肠道微生物的Shannon和Observed_species指数均显示出降低的趋势（图1A、B），但差异无统计学意义（P ＞0.05）。加权的主坐标分析（weighted principal coordinate analysis，WPCoA）结果表明：3 组患者之间的肠道菌群差异有统计学意义（P＜0.05，图1C）。

表1 研究人群的临床特征Tab.1 Clinical characteristics of the study cohort M（Q1，Q3）

2.2 高血压不同危险分层患者肠道菌群显著性差异分析基于Qiime 1.9.0软件分析得出的肠道菌群相对丰度，进一步应用R3.5.2 软件分析组间物种属水平的差异。结果显示高血压低中危组、高危组和很高危组的肠道菌群的组成存在显著差异，罗斯氏菌属（VH vs. LI，P＜0.001；H vs. LI，P＜0.01）和Anaerostipes 菌属（VH vs. LI，P＜0.01；H vs. LI，P＜0.01）在很高危组和高危组中的丰度相对低中危组显著降低，而很高危组放线菌属（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、瘤胃球菌属（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）、毛螺旋菌属（VH vs.H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.01）、嗜胆菌属（VH vs.H，P＜0.001；VH vs. LI，P＜0.05）和SMB53 菌属（VH vs. H，P＜0.05；VH vs. LI，P＜0.05）的相对丰度显著低于高危组和低中危组（图2）。

图1 3 组患者之间肠道微生物多样性分析Fig.1 Analysis of gut microbiota diversity between three groups of patients

图2 3 组患者之间存在显著差异的菌属Fig.2 Significant differences between the three groups of bacteria

2.3 肠道菌群与Score 评分相关性分析为了探究肠道菌群与高血压患者发生心血管事件风险的关联，本研究统计了入组患者的年龄、性别、血清肌酐、心脏射血分数、肺动脉压、既往病史（如心脏疾病、糖尿病、慢性肺病、心脏外动脉疾病等）等临床指标，根据EuroScoreⅡ3 系统进一步计算出患者的Score 评分，并就其与肠道微生物作Spearman 相关性分析，结果显示，克雷伯氏菌属（r = 0.238，P＜0.05）和颤螺旋菌属（r=0.243，P＜0.05）的丰度与Score 评分呈正相关，而毛螺旋菌属（r=-0.491，P＜0.001）和罗斯氏菌属（r =-0.385，P＜0.01）的丰度与Score 评分呈负相关（图3）。

3 讨论

既往多项研究［6，11］表明，高血压患者存在明显的肠道菌群紊乱及肠黏膜屏障功能失调，而且，肠道菌群在阻塞性呼吸睡眠暂停大鼠诱导高血压过程中发挥关键作用［12］，以上显示肠道菌群在高血压发生过程中的重要地位，提示肠道菌群检测具有疾病诊断和风险评估的潜在价值，同时有可能成为高血压新的干预靶点。本研究通过分析不同心血管危险分层高血压患者肠道菌群的差异，探索高血压危险分层相关的疾病特征菌，为基于机器学习的心血管事件风险评估模型提供理论依据。研究结果显示不同危险分层的高血压患者，其肠道菌群的α多样性差异无统计学意义，菌群相对丰度存在显著差异。

图3 Score 评分与菌属之间Spearman 相关性分析Fig.3 Spearman correlation analysis between the Score value and bacteria

在属的水平，很高危组及高危组患者的罗斯氏菌和Anaerostipes 菌的相对丰度较低中危组的患者显著降低，而放线菌、瘤胃球菌、毛螺旋菌、嗜胆菌和SMB53 在很高危组患者中的相对丰度显著低于高危组及低中危组患者（P＜0.05）。据报道，罗斯氏菌和Anaerostipes 为丁酸产生菌［13］，丁酸盐可以通过上调肠上皮紧密连接蛋白的表达来维持肠粘膜完整性，进而阻止脂多糖、三甲胺等有害产物进入血液［14］。毛螺旋菌为丙酸产生菌［13］，瘤胃球菌的主要发酵产物为乙酸［15］，而乙酸、丙酸和丁酸均属于短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），是肠道微生物发酵膳食纤维产生的代谢物。既往研究发现，SCFAs 可以通过嗅觉感受器受体（olfactory receptor78，Olfr78）和G 蛋白偶联受体41（G protein-coupled receptor 41，Gpr41）调控血压，从而维持血压的稳态［16］。MARQUES 等［17］也证实了高纤维饮食和补充乙酸酯均可以明显降低盐皮质激素诱导的小鼠血压水平、减少心肌纤维化和左心室肥厚，其机制是通过调节心脏和肾脏Egr1、肾脏RAAS 和心脏MAPK 的表达来发挥作用的。本研究也发现产生SCFAs 的罗斯氏菌、Anaerostipes、毛螺旋菌和瘤胃球菌的丰度随着高血压心血管危险程度的增加而显著降低，提示SCFAs 有可能成为评估心血管事件的新的风险预测因子，但仍需进一步研究证实。

此外，本研究通过Spearman 相关系数分析发现罗斯氏菌属和毛螺旋菌属丰度与Score 评分呈负相关，而克雷伯氏菌属和颤螺旋菌属丰度与Score 评分呈正相关（P＜0.05）。既短链脂肪酸产生菌罗斯氏菌和毛螺旋菌的丰度与高血压10年心血管事件发生风险呈负相关。因此，本研究推测这两种菌可能是降低心血管危险的有益菌。最近发表在Nature Microbiology 的一项研究表明，通过给ApoE-/-无菌小鼠定殖不同产丁酸能力的特定菌群，发现在富含植物多糖的饮食作用下，肠道罗斯氏菌可调节结肠表观遗传，使肠细胞从糖酵解向利用脂肪酸转变，降低内毒素和炎症反应，延缓动脉粥样硬化的发展［18］。这与本研究结果是互为补充的。克雷伯氏菌和颤螺旋菌与高血压10年心血管事件发生风险呈正相关。已有研究［7］报道，在高血压前期和高血压人群中普氏菌和克雷伯氏菌以及与疾病相关的微生物过度生长。并且，克雷伯氏菌可以通过脂多糖激发的免疫应激导致炎症反应［19］。这提示，通过微生态制剂调节调整肠道微生态的平衡可能有助于肠道正常菌群的恢复，从而预防心血管事件的发生，但仍需更有力的实验数据支持。

本研究存在一定的局限性。首先，入选人群均来自南方医科大学南方医院门诊和住院病人，具有明显的地域局限性。其次，由于对本研究的纳入及排除标准进行了严格控制，导致入组的人数有限，这对研究结果的普遍性也具有一定的影响，还需更大样本研究加以证实。另外，肠道菌群及其代谢产物（如SCFAs）和高血压心血管危险分层之间的因果关系也需要动物实验进一步验证。

综上所述，本研究对不同心血管危险分层高血压患者肠道菌群的组成及多样性做了初步探索，证实高血压发生心血管事件的风险与肠道菌群之间存在一定的关系。通过构建相关模型，肠道菌群有望成为一项新的预测和监控高血压发生心血管事件风险的临床指标。