响应面法优化牡蛎多肽酶解工艺的研究

陈弘培 ，刘艺琳 ，龚世禹 ， 刘 斌 ，3， 曾 峰

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.福建农林大学海洋研究中心，福建福州 350002；3.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建福州 350002）

随着社会的发展，海洋中蕴藏的对人类健康有益的生物活性物质或功能性成分逐渐受到研究者的关注。海洋生物已成为发现新型生物活性成分和研究功能性食品的重要来源。牡蛎又称为生蚝，属于软体动物门、瓣鳃纲、异柱目、牡蛎科，是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。牡蛎是一种高营养的海洋动物[1]，同时也是药食同源的保健品[2]。牡蛎（Oyster），被誉为“海洋里的牛奶”，富含蛋白质和对人体重要的锌元素。牡蛎体内含糖原[3]，10种人体必需的氨基酸，牛磺酸含量尤其丰富[4]。牡蛎中含有 Cu，Zn，Mn，Ba，P，Ca等无机物，研究发现牡蛎具有抗肿瘤、降血压、护肝、抗氧化、抗疲劳、抗病毒、抑菌等功能。

当今世界对食品多肽的研究日益重视，不仅因其具有较高安全性，相对于蛋白质，多肽更易被人体吸收利用。此外大多数多肽具有抗氧化等功能。因此，在功能保健食品方面将具有发展前景。郭溆等人[5]利用黄秋葵籽粕蛋白，采用酶解法获得具有抗氧化活性的多肽。徐浩等人[6]制备了河蚬酶解液，发现分子量小于5 kDa的抗氧化活性最高。芦鑫等人[7]发现碱性蛋白酶酶解芝麻蛋白表现出较强抗氧化的水平。试验通过响应面优化设计，对牡蛎多肽的酶解工艺进行了研究，以提高牡蛎多肽的利用，为牡蛎的综合利用提供了新思路。

1 材料与仪器

1.1 原料

牡蛎（Oyster），购于福州市金山大润发超市，敷冰运回实验室后，将新鲜牡蛎洗净，经高速组织匀浆机斩拌均匀，于-20℃下冷冻备用；中性蛋白酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶 （1.0×105U/g）、风味蛋白酶 （1.0×105U/g）、胰蛋白酶 （2.5×105U/g），购于北京索莱宝科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），购于上海源叶生物有限公司；牛血清蛋白，购于美国Sigma公司；其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器

SHA-B型水浴摇床，金坛市精达仪器制造有限公司产品；MINI8-UV型超纯水机，湖南科尔顿水务有限公司产品；pH值计；MIKRO220R型高速冷冻离心机，Andreas Hettich GmbH&Co.KG产品；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；C21-SH2140型电磁炉（美的）；61010-1:2ND型冷冻干燥机，Kansascity，missouri产品；SpectraMax i3型酶标仪，Molecullar debices产品；BL25B31型搅拌机，广东美的生活电器制造有限公司产品。

2 试验方法

2.1 牡蛎基本组成及氨基酸分析

水分测定：GB 5009.3—2016；灰分测定：GB 5009.4—2016；蛋白质含量测定：GB 5009.5—2016；脂肪测定：GB 5009.6—2016；氨基酸的分析：GB 5009.124—2016。

2.2 不同蛋白酶的酶解度、氮素回收率和抗氧化活性的影响

称取适量牡蛎肉糜按照料液比为1∶6加入超纯水，在各蛋白酶最适温度的恒温水浴中均匀搅拌，保温一段时间，调节pH值至最适值，每克肉糜中加入1 000 U活力的酶，时间为5 h。

牡蛎肉糜的酶解参数见表1。

表1 牡蛎肉糜的酶解参数

每隔1 h取酶解液高温灭酶，直至结束。调节酶解液pH值至7，低温高速离心，收集上清液冷冻，测定指标。

2.2.1 酶解度的测定

参照王雪芹等人的方法[8]。

2.2.2 氮素回收率的测定

参照王雪芹等人的方法。

2.2.3 牡蛎酶解液清除DPPH·活性

参照Hua D等人[9]的方法。

2.3 牡蛎多肽制备单因素试验

根据2.2的结果选酶。以加酶量、酶解时间、酶解温度、pH值和料液比为因素，DPPH·清除率来评定单因素的最适条件。

2.4 响应面优化牡蛎酶解液的酶解工艺

使用Design Expert 8.0软件对牡蛎抗氧化条件进行优化，并测定优化后的DPPH·清除率。

3 结果与分析

3.1 牡蛎基本组成及氨基酸分析

牡蛎的一般营养成分见表2。

表2 牡蛎的一般营养成分/%

由表2可知，牡蛎是一种高蛋白质、低脂肪的食品材料。高脂肪的物质在酶解中产生不良风味，影响保质期。一般情况下在酶解前会去除材料中所含的脂肪。不过此做法会增加生产成本，此外除脂肪的过程中残留的试剂，可能导致蛋白质部分变性，造成食品安全隐患。而牡蛎高蛋白、低脂肪的原料特点，使得它非常适于作为酶解底物，且无需进行脱脂处理。

牡蛎中必需氨基酸的含量为35.35%，牡蛎中鲜味氨基酸的含量为45.42%。支链氨基酸含量达14.88%，能够合成蛋白质，在一些时期还可提供能量[10]，以及改善运动对心肌的代谢[11]。牡蛎中几种关键抗氧化氨基酸（His，Tyr，Met）占10.70%，说明其具有潜在的抗氧化活性。

牡蛎肉糜组分的氨基酸组成分析见表3。

3.2 牡蛎多肽制备单因素试验

牡蛎肉糜各蛋白酶酶解产物的活性见图1，不同蛋白酶对牡蛎DPPH·清除率的测定见图2。

由图1可知，酶解度在4 h达到一个最大值，在5 h则开始下降，氮素回收率在4 h也较高。故测定酶解时间为4 h时的DPPH·的清除能力。4 h时，4种蛋白酶的酶解度达到最大值，氮素回收率也较高，中性蛋白酶的效果较高。因此，以中性蛋白酶作为最佳用酶。

3.2.1 加酶量

其他4个因素不变的情况下，中性蛋白酶加酶量的条件分别为1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 U/g。

加酶量对DPPH·清除率的影响见图3。

表3 牡蛎肉糜组分的氨基酸组成分析

在一定范围内，DPPH·清除率随着加酶量的增多先上升后下降，加酶量1 400 U/g达到最高值71.82%，若加酶量过低，则会导致底物酶解不彻底，若加酶量过多，会改变酶解液的颜色，产生不良气味。所以选1 400 U/g为最适加酶量。

3.2.2 pH值影响

其他4个因素不变的情况下，pH值的条件分别为 6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。

pH值对DPPH·清除率的影响见图4。

在pH值为7.0的时候达到最大值70.52%，由此得出在酸碱环境下都会影响其抗氧化活性，此外调节pH值也不利于后期的样品处理。所以选择pH值为7.0。

3.2.3 酶解温度

其他4个因素不变的情况下，酶解温度的条件分别为40，45，50，55，60℃。

酶解温度对DPPH·清除率的影响见图5。

酶解液在50℃时，DPPH清除率最高，为65.41%，温度过低则蛋白酶的活性无法完全体现，而高温会导致蛋白酶失活，所以选择50℃为温度。

3.2.4 酶解时间

其他4个因素不变的情况下，酶解时间的条件分别为 3，4，5，6，7 h。

图1 牡蛎肉糜各蛋白酶酶解产物的活性

酶解时间对DPPH·清除率的影响见图6。

酶解时间为4 h时，DPPH·清除率达到最高值66.10%，之后开始下降。倘若酶解时间过短，则底物无法完全水解，酶解时间过长，其风味将发生改变，制备成本变高。所以选择4 h为酶解时间。

3.2.5 料液比

其他4个因素不变的情况下，料液比为1∶3，1∶6，1∶10，1∶15，1∶20。

料液比对DPPH·清除率的影响见图7。

当料液比为1∶10，DPPH清除率达到最大值68.98%，在适宜条件下，增加料液比可促进蛋白酶催化，但料液比过大时，导致蛋白酶浓度下降。所以选择料液比为10∶1。

图2 不同蛋白酶对牡蛎DPPH·清除率的测定

图3 加酶量对DPPH·清除率的影响

图4 pH值对DPPH·清除率的影响

图5 酶解温度对DPPH·清除率的影响

图6 酶解时间对DPPH·清除率的影响

图7 料液比对DPPH·清除率的影响

牡蛎酶解产物的各因素最优条件见表4。

表4 牡蛎酶解产物的各因素最优条件

3.3 牡蛎多肽制备的响应面优化试验

3.3.1 响应面优化试验因素水平的选取

在单因素水平上，对pH值、料液比和酶解时间进行三因素三水平优化。

响应面分析法因素与水平设计见表5，响应面试验设计及结果见表6。

表5 响应面分析法因素与水平设计

表6 响应面试验设计及结果

根据表6试验结果得到二次回归方程（1）：

清除率=75.17+1.35A+1.16B+2.06C-0.82AB-

1.31 AC+0.70BC-3.00A2-1.57B2-2.74C2.

其中A，B，C分别代表pH值、料液比和酶解时间。

响应面试验方差分析见表7。

表7 响应面试验方差分析

3.3.2 响应面优化实验作图分析

pH值和料液比对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响见图8。

图8 pH值和料液比对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响

由图8可知，料液比和pH值的相互作用不明显，方差分析结果也表示作用不明显。pH值恒定时，料液比的增加，DPPH·清除率先上升后下降，不过改变不明显，料液比恒定时，DPPH·清除率随着pH值的提高，先增大后减小，变化明显，在7.0时清除率最大。

pH值和酶解时间对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响见图9。

pH值为7.0时，随着酶解时间的延长，其DPPH·清除率先上升后下降，3 h和5 h时DPPH·清除率最低，而在4 h时DPPH·清除率最大。酶解时间特定时，DPPH·清除率随pH值的升高也出现相同的变化。

酶解时间和料液比对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响见图10。

图9 p H值和酶解时间对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响

图10 酶解时间和料液比对牡蛎酶解产物的DPPH·清除率影响

由图10可知，在酶解时间恒定时，随着料液比的增加，DPPH·清除率先上升随后下降，在料液比为1∶10时达到最高，从图10可知料液比对DPPH·清除率的影响非常显著。

3.3.3 响应面法验证性试验

通过Design Expert软件优化后进行分析，测定牡蛎酶解液最高DPPH·清除率，其条件为pH值7.08，酶解时间4.34 h，料液比1∶11.84。预计清除率75.84%，在此条件下进行了验证，结果发现优化后清除率为74.43%±0.32%，实际清除率和预计清除率无差异性（p＞0.05），拟合度较好。

4 结论

以牡蛎为研究对象，在中性蛋白酶酶解制备牡蛎多肽的的试验中，综合考虑了酶解度、氮素回收率和DPPH·清除率等因素。发现加酶量、酶解时间、料液比、pH值、酶解温度对DPPH·清除率具有一定影响。在单因素试验的基础上，以DPPH·为优化指标，采用响应面法优化制备工艺。当酶解温度50℃，pH值7.0，酶解时间4 h，料液比1∶10，加酶量1 400 U/g，优化后DPPH·清除率达到74.43%。