布鲁氏菌eryA基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

宋前进，杭天宇，乌东高娃，李伊铭，关平原，温永俊

（内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

布鲁氏菌是一种胞内寄生的革兰氏阴性菌[1-2]，抵抗力较强，在土壤、毛皮、病畜的脏器及其分泌物中可生存数周至数月[3]。该病原体主要寄生于人或动物的巨噬细胞内，有逃避先天性免疫的能力[4]。布鲁氏菌病是一种重大的人兽共患传染病[5]，人类患病后表现为布氏热、关节炎等症状，且较难恢复；家畜患病后主要引起母畜流产,也可引起乳腺炎、子宫炎、睾丸炎等症状[6]。该病给人类健康及畜牧业发展造成严重威胁[7]。

反刍动物和猪对布鲁氏菌高度易感。布鲁氏菌特征性地侵害其生殖器官并导致母畜流产和不孕。当患病母畜分娩时，胎盘组织中布鲁氏菌达到极高数量，每克组织中细菌数可高达1014个，因此母畜流产是该病的传染性病症[8]。据资料[9]报道，这种趋向性和广泛繁殖与易感动物生殖器官中的高赤藓糖醇浓度有关。布鲁菌特征性地侵害宿主的生殖器官并导致母畜流产和不孕，其主要是因为赤鲜糖醇是由怀孕动物胎盘组织产生的，可作为一种生长剂和碳源促进布鲁菌在体内的增殖[10]，并会诱发炎症细胞浸润、滋养层细胞坏死及先导性血管炎[11]。因此最终导致胎儿-母体代谢交换受损，导致胎儿流产[12]。Mukherjee等[13]通过体内试验观察到，非肠道注射赤藓糖醇会增加腹膜感染小牛脾脏中布鲁氏菌数量。Sangari等[14]对B.abortus 2308株赤藓糖醇基因的研究显示，该基因全序列有7 714 bp，操纵子、启动子位于5′-ery A并含IHF（整合宿主因子）结合点，eryA影响整个基因的转录表达。吴冬玲等[13]对布鲁氏菌S19和A19基因进行序列比对及克隆测序，证实S19缺失的702 bp基因序列位于eryC和eryD之间。目前，赤藓糖醇基因被认为是布鲁氏菌感染的主要因素之一，有很大的研究价值。

为此，本试验通过对布鲁氏菌赤藓糖醇基因eryA的克隆、表达、纯化及生物信息学分析，探索该基因编码蛋白的免疫原性，以期为布鲁氏菌诊断方法及iELISA诊断试剂盒的建立提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂 羊种布鲁氏菌Rev.I株：由金宇宝林有限公司提供；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株、BL21（DE3）菌株及pET-30a 载体：由本实验室保存；DNA Marker：购自大连宝生物工程有限公司；T4连接酶：购自NEB公司；限制性内切酶（EcoRI/XhoI）、2×Es TaqMasterMix、细菌质粒小提取试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒：购自Thermo Fisher Scientific公司；HRP标记的兔抗羊IgG抗体：购自Abcom公司；蛋白Marker：购自北京全式金公司；显色剂：购自碧云天生物公司。

1.1.2 主要仪器 超净工作台、PCR仪、制冰机、超速离心机、恒温培养箱、恒温振荡器、高速冷冻离心机、超声波细胞粉碎机、水浴锅、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、蛋白纯化仪等。

1.2 方法

1.2.1 目的基因扩增 将羊种布鲁氏菌Rev.I株灭活菌液（水浴锅中85 ℃灭活1 h），按细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行菌体DNA提取。根据GenBank中登录的布鲁氏菌U57100 ery基因序列中eryA基因设计引物（表1），并由北京华大基因有限公司合成。目的基因PCR扩增采用25 μL反应体系：Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上游引物1 μL、下游引物 1 μL、DNA 模板 1 μL。反应条件为：95 ℃变性3 min；94 ℃变性45 s，35个循环，55 ℃ 退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，最后 72 ℃延伸10 min。所得PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。回收目的基因片段，将其与pMD19-T载体在16 ℃条件下连接，构建重组质粒pMD19-T-eryA。重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，然后进行菌液PCR并送往北京华大有限公司进行测序鉴定，将测序结果在GenBank中进行比对。

表1 eryA基因引物序列

1.2.2 原核表达载体构建 将送公司测序正确的质粒pMD19-T-eryA和pET-30a载体用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET-30a载体。将回收的产物按一定摩尔比在16 ℃金属浴中过夜连接，后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于卡那抗性平板培养12～16 h，对阳性克隆进行摇菌提取质粒，并进行菌液RCR检测及质粒双酶切鉴定。

1.2.3 重组蛋白SDS-PAGE电泳检测 从转化的平板上，挑单克隆到15 mL含相应抗性的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD=0.6～0.8，用 0.5 mmol/L的 IPTG，37 ℃，200 r/min诱 导培养2 h；取1 mL诱导菌液，12 000 r/min，离心1 min，弃上清；将沉淀用 10 mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液吹散，将等体积的缓冲液及2×loading buffer加入到1.5 mL离心管中，100 ℃煮10 min；SDS-PAGE电泳检测后，按照1∶50比例接菌到卡那抗性的 LB液体培养基中进行诱导表达。

1.2.4 重组蛋白纯化 用去离子水洗镍柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare）至 pH7.0；挂镍至pH2.0～pH3.0，再用去离子水洗镍柱至pH7.0；用约100 mL的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡镍柱，再用约50 mL含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化钠、10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡镍柱，最后用含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化钠、10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液对样品稀释上样；上样结束后，用含8 mol/L尿素、0.5 mol/L氯化钠、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液洗柱，再分别用含15、60、500 mmol/L咪唑和10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，然后电泳检测蛋白纯化效果。

1.2.5 重组蛋白Western-blot检测 对纯化蛋白进行SDS-PAGE后转移到PVDF膜上，14 V电压电转50 min；将膜放入预先用PBST缓冲液洗涤后的平皿，用1%的脱脂乳4 ℃过夜封闭，用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15 min；加入1∶500稀释的，经本实验室用虎红平板凝集试验鉴定的羊种布鲁氏菌阳性血清，37 ℃孵育4 h；用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15 min，然后加入1∶5 000稀释的辣根过氧化氢酶标记的兔抗羊IgG抗体，37 ℃孵育2 h；PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次15 min，后用显色剂显色后拍照。

1.3 生物信息学分析

利用TMHMM Serverv.2.0在线软件预测eryA蛋白的跨膜结构，利用SignalP 4.1 Server在线软件预测eryA蛋白的信号肽；通过SOPMA在线软件分析eryA蛋白的二级结构，通过Phyre2在线服务器预测eryA蛋白的三级结构，利用Predicting Antigenic Peptides在线软件预测eryA蛋白的抗原决定簇。

2 结果与分析

2.1 目的片段扩增及原核质粒构建

羊种布鲁氏菌的eryA基因片段大小为1 563 bp，PCR 扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，与预期大小一致（图1）。用限制性内切酶EcoRI和XhoI对质粒pET-30a及目的片段进行双酶切后，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果与预期条带相符（图2）。

2.2 重组蛋白SDS-PAGE电泳检测

处理破碎的样品，然后加入与缓冲液等体积的 2×loading buffer，100 ℃煮 5 min，电泳检测，结果如图3、图4。SDS-PAGE 分析显示，eryA基因在63 kD处有明显条带，主要表达在沉淀中，且大小与预期结果一致。

图1 PCR扩增或胶回收产物

图2 双酶切PCR回收产物和pET30a载体

图3 SDS-PAGE检测蛋白表达

2.3 蛋白质纯化

对沉淀样品分别用含15、60、500 mmol/L咪唑 和 10 mmmol/L Tris-HCl（pH8.0， 含 8 mmol/L尿素、0.5 mmol/L氯化钠）溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测蛋白纯化效果，结果纯化出相应的蛋白（图5）。图6为纯化后的SDS-PAGE胶图。

图4 SDS-PAGE电泳分析蛋白在沉淀中表达

图5 目的蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图

图6 纯化后SDS-PAGE电泳图

2.4 Western-Blot检测

对诱导8 h后的重组蛋白纯化后进行Westernblot检测，14 V电压下转膜50 min，孵育羊布鲁氏菌阳性血清，可见明显的目的条带，说明诱导得到的重组蛋白能被HRP标记的羊抗鼠IgG抗体识别，且大小与 pET-30a分子质量加上目标分子蛋白质量的重组蛋白总分子质量相符（图7）。

图7 Western-blot检测结果

2.5 目的蛋白生物信息学分析

通过TMHMM Serverv.2.0在线软件，分析羊种布鲁氏菌的eryA蛋白氨基酸序列的跨膜结构，发现该蛋白无跨膜区（图8）；利用SignalP 4.1 Server在线软件预测羊种布鲁氏菌的eryA蛋白的信号肽，发现该蛋白无信号肽（图9）；利用Predicting Antigenic Peptides在线软件，预测羊种布鲁氏菌的eryA蛋白的抗原决定簇，发现该蛋白共有21个抗原决定簇（图10）。

图8 跨膜区预测

图9 信号肽预测

经SOPMA在线软件分析得出，该蛋白中参与形成 α-螺旋的氨基酸有233个，占比为44.81%；参与无规卷曲的结构的氨基酸有174个，占比为33.46%；参与延伸链形成的氨基酸有75个，占比为14.42%；参与β-转角形成的氨基酸有38个，占比为11.51%（图11）。蛋白质的三级结构含多种二级结构单元且有明显的折叠层次。通过在线软件Swiss Model预测该蛋白的三级结构，发现其三级结构中有大量的α-螺旋及相应的无规卷曲和β-转角结构，这对该蛋白的稳定起重要作用（图12）。

3 讨论

图10 抗原位点预测

图11 eryA蛋白二级结构预测

布鲁氏菌病流行范围广，对全球反刍动物和猪的养殖带来了巨大经济损失。我国各省（市、区）均有不同程度的人畜布鲁氏菌病流行，其防制、检测及净化是现阶段关注的重要问题。布鲁氏菌有5个经典种，基因组同源性较高，但不同株之间的毒力差异较显著，这给其临床诊断及疫苗防治造成了不利影响，因此探索对布鲁氏菌检测及疫苗的创新研究很有必要。eryA基因作为布鲁氏菌的重要毒力基因之一，有很大的研究价值。有研究发现，人患布鲁氏菌病后的流产现象较动物自然流产更少，这可能是因为人的胎盘和胎儿中不存在赤藓糖醇[14]，其相关机制有待研究。Smith等[15]对患布鲁氏菌病动物不同脏器中的赤鲜糖醇含量进行了测定，发现胎盘和胎儿中赤藓糖醇含量最高，因此怀疑流产可能和赤藓糖醇含量有关。Agüero等[16]研究发现，减毒株S19因缺失赤藓糖醇的702 bp基因，使其成为唯一受赤藓糖醇抑制的菌株，其他布鲁氏菌均能利用赤藓糖醇，因此赤藓糖醇基因在布鲁氏菌毒力代谢中起重要作用。Petersen等[17]建立了小鼠赤藓糖醇位点模型，通过控制细胞内外赤藓糖醇的浓度发现，若胞外赤藓糖醇含量高于胞内时，细胞外布鲁氏菌的含菌量将会升高。因此，需要对赤藓糖醇基因进行深入研究。

图12 eryA三级结构预测

本试验应用生物信息学软件，对赤藓糖醇基因eryA进行分析，发现其编码的eryA蛋白没有跨膜结构，不能进行胞内外信号转导等生命活动。经软件预测，eryA蛋白没有信号肽，属于非分泌型蛋白。eryA蛋白拥有一定数量的抗原表位，表明eryA蛋白作为抗原能引起良好的免疫应答反应，可以与布鲁氏菌病阳性血清抗体发生特异性结合，因此既可作为布鲁氏菌病诊断抗原，用于ELISA试剂盒建立，也可用于合成肽研究，用于布鲁氏菌病检测及诊断。本研究成功构建了eryA蛋白的三维模型。该模型具有一定的可信度，有利于蛋白结构和功能的可视化分析，如大量的α-螺旋结构可将疏水侧链埋藏在分子内部，从而增加该蛋白的可溶性。总之，布鲁氏菌与宿主的相互作用是一个非常复杂的过程。本研究通过构建布鲁氏菌eryA基因的原核表达载体并对其反应原性进行鉴定以及生物信息学分析，为进一步研究赤藓糖醇基因在布鲁氏菌感染宿主细胞过程中所发挥的生物学功能提供了依据。