牦牛卵巢颗粒细胞中Bmal1基因的表达试验

赵明旺 ， 张 君 ， 徐尚荣 ， 彭 巍 ， 舒 适 ， 黄 荣 ， 张琳钦 ， 关凯文

(1.青海大学农牧学院 ，青海 西宁 810016 ; 2.青海大学畜牧兽医科学院 ， 青海 西宁 810016)

生物节律指动物为了适应环境，在生命活动中，从分子、细胞到机体等不同层次上都有明显的时间周期现象[1]，包括近日节律和长日节律。而近日节律是最重要的一种生物节律，是以近似24 h为周期的自主维持振荡器，主要受生物钟基因的调控，包括Bmal1(Brainandmusclearnt-like1，Bmal1)，Clock(Circadianlocomotoroutputcycleskaput，Clock)、Per(Period，Per)和Cry(Cryptochrom，Cry)等。其中，Bmal1是调控节律基因的核心元件，能和Clock形成异二聚体，并与其他钟基因(如Per、Cry等)启动子区的E-box元件结合，驱动这些基因的表达，从而调节生物体的生命活动。哺乳动物的生物钟基因最早被定位于下丘脑视交叉上核(Suprachiasmatic nuclei，SCN)， 但随着研究的深入，学者们发现生物钟基因在其他外周组织中也有表达[2-4]，说明生物钟基因除了在生物节律中起作用外，在动物机体其他代谢中也发挥着重要的作用。研究指出，生物钟基因在丘脑-垂体-性腺系统轴的组织中表达，参与调节性腺的发育和功能[5-6]。同时有研究发现，在卵泡合成孕酮的过程中，类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)和3β-羟化类固醇脱氢酶(3-βHSD)呈现昼夜节律性表达，对其启动子区的分析发现存在Bmal/Clock的作用靶点E-box[7]。Bmal1对动物黄体的形成和孕酮(P4)的分泌，甚至对动物的排卵周期以及胚胎发育都有影响[8-9]。这些研究说明生物钟基因参与动物的生殖调控，对动物的繁殖有一定的影响。因此，研究生物钟基因在动物生殖系统中的表达规律与功能，对畜牧业的发展具有重要意义。

牦牛(Bosgrunniens)作为高原地区农牧民的主要生活和生产资料，其所处的环境特殊，繁殖性能低下，近年来关于牦牛繁殖性能的研究颇多，但有关牦牛卵巢颗粒细胞中是否存在生物钟基因尚未见有关报道。因此，本试验以分离培养的母牦牛卵巢颗粒细胞为研究对象，分离培养卵巢颗粒细胞，运用免疫荧光对Bmal1蛋白表达进行定位，并用qRT-PCR技术检测该基因在不同培养时间牦牛颗粒细胞中的表达情况，以确定Bmal1基因的节律性表达规律，为下一步研究Bmal1对牦牛颗粒细胞生物学功能的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 西宁市裕泰屠宰场健康母牦牛。用灭菌剪刀剪取卵巢，生理盐水冲洗干净，置于盛有36 ℃生理盐水及双抗的保温杯中。

1.1.2 主要试剂 DMEM、10%胎牛血清，购自Gibico公司；地塞米松购自Sigma公司；TransZolUp Plus RNA Kit、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，购自北京全式金生物技术有限公司；Bmal1兔多克隆抗体购自Abcam公司；反转录试剂盒、Green Premix，购自大连宝(TaKaRa)生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱，为美国Thermo产品；倒置荧光显微镜，为Nikon产品；核酸蛋白仪，为Thermo产品；普通PCR仪，为Eppendorf产品；电泳仪，为Hoefer公司产品；凝胶成像系统，为天美(中国)科学仪器有限公司产品；qRT-PCR仪(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System)，为Applied Biosystems产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI数据库中已知的牦牛Bmal1(登录号：XM_014477271.1)基因序列和内参基因GAPDH(登录号：XM_014482068.1)引物序列，利用Oligo7.0软件设计荧光定量引物(见表1)。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 Bmal 1和GAPDH引物序列

1.2.2 牦牛卵巢颗粒细胞的分离 从屠宰场采集健康的牦牛卵巢，在2-6 h内送回实验室细胞间内。剪掉卵巢上的结缔组织，用生理盐水清洗3次。吸取卵泡液于盛有5%胎牛血清(FBS)的15 mL离心管中，常温离心5 min(1 200 r/min)，弃去上清液。用加有双抗的PBS离心清洗重复5次。细胞筛过滤,得到较为纯净的牦牛颗粒细胞。

1.2.3 牦牛颗粒细胞体外培养 将处理好的牦牛颗粒细胞按照适当的细胞浓度，在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养基，分别装入细胞瓶中，于5%CO2，95%空气，37 ℃，饱和湿度的培养箱中培养。24 h之后观察细胞生长情况，弃掉原培养基，用PBS清洗3遍，再换上新的培养基继续培养。48 h后细胞长满瓶底时，进行细胞传代：弃掉原有培养基，PBS清洗3遍，向每个细胞瓶中加入1 mL胰酶消化5 min后，等量的血清终止消化，吹打混匀离心(1 200 r/min，5 min)；向每管细胞沉淀中加入500 μL培养基，混匀，集中于15 mL离心管中，混匀，细胞计数；按照计数好的细胞浓度，平均分装至35 mm平皿中，并加入1 mL培养基进行培养，细胞数为每个平皿105个。

1.2.4Bmal1基因在颗粒细胞中的定位 当原代细胞生长至平皿90%时，胰酶消化，制备单细胞悬液，将4×105个/mL的细胞悬液注入放有8 mm圆形载玻片的35 mm细胞培养皿中，培养箱中培养24 h，细胞长至贴壁面近80%时，取出细胞爬片，用PBS冲洗3遍(1 min/遍)，4%多聚甲醛固定15 min，进行细胞免疫化学染色：PBS清洗3遍；0.4%Triton通透细胞膜10 min，随后以即用型正常山羊血清封闭30 min，然后加入一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜；加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室温避光1 h；最后加入1 mg/L的Hoechst33258，室温5 min，荧光显微镜下观察。同时用PBS代替一抗作阴性对照

1.2.5Bmal1基因节律性的体内模拟试验 传代细胞培养24 h后，根据文献，地塞米松能够模拟体内节律性，本试验向每个平皿中加入100 nM的地塞米松处理2 h[10]，弃掉原含有地塞米松的培养基，PBS清洗3遍，换入新的培养基继续培养。从加入新的培养基开始，每隔4 h(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)进行细胞收集并提取RNA。每个试验设置3个重复。

1.2.6 颗粒细胞RNA的提取和cDNA的合成 对颗粒细胞的总RNA进行提取，提取方法按照TransZolUp Plus RNA Kit试剂盒说明书进行。取6 μL提取的RNA经2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用核酸蛋白仪检测RNA浓度。cDNA合成各组RNA的量为700 ng，转录方法按照说明书进行。得到的cDNA分别作为常规PCR和qRT-PCR的模板，并放置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.7 常规PCR检验Bmal1引物的特异性 PCR反应体系为25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 6.5 μL，cDNA 2 μL。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 min，退火30 min(退火温度见表1)，72 ℃ 30 min，35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL扩增产物经2%琼脂凝胶电泳进行试验：电压100 V，时间30 min。

1.2.8 qRT-PCR 分别检测Bmal1在24 h内不同时间点的表达量。反应体系为20 μL：Premix 10 μL、Dye 0.4 μL、ddH2O 6 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL；反应条件参照产品说明书。每组试验样品重复4次试验，每个样品的目的基因和内参基因GAPDH分管同板以相同条件扩增。

1.2.9 数据处理 用2-△△Ct法对数据进行处理。用余弦分析软件进行基因的节律性分析，并获取节律性参数。IBM SPSS Statistics 19.0统计软件进行数据分析，组内差异进行t检验，同组不同时间点的数据用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有数据以“均数±标准差”表示。

2 结果

2.1Bmal1在牦牛颗粒细胞中的定位表达 对牦牛颗粒细胞进行免疫荧光染色，红色为目的蛋白标记，蓝色为细胞核标记。结果(见中插彩版图1)显示，体外培养细胞已经贴壁，经过免疫组化染色红色标记后得知，Bmal1蛋白在牦牛颗粒细胞的细胞质中表达分布。

图1 Bmal1蛋白在牦牛颗粒细胞中的表达A：正常镜下的颗粒细胞 ； B：目的蛋白荧光染色 ； C：细胞核染色 ； D：合并

2.2 牦牛卵巢颗粒细胞总RNA的提取 用核酸蛋白仪检测提取的RNAOD260/OD280的比值均在1.8～2.0之间，说明RNA纯度高。再经过2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果显示，28S RNA和18S RNA条带清晰可见(图2)，说明提取的总RNA完整性强，无降解。两者结果表明，提取的RNA均符合要求，可以用于后续试验。

2.3 常规PCR检验引物的特异性 取5 μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检验，电压100 V，时间30 min，在琼脂糖凝胶成像系统清晰观察到在胶上119 bp和140 bp处均为单一条带，说明引物特异性好并且与预期的片段长度是相符的(图3)，引物可用于后续试验工作。

图2 总RNA提取结果
M：DNA标准 DL-2 000 ； 1～3：牦牛卵巢颗粒细胞总RNA电泳图

图3 Bmal1和GAPDH的扩增结果
M：DNA标准 DL-500 ； 1～2：Bmal1 ； 3～4：GAPDH

2.4Bmal1在颗粒细胞中不同时间段的表达量分析 地塞米松模拟试验处理后，在体外培养24 h内不同时间点Bmal1基因在颗粒细胞的相对表达量见表2。对Bmal1基因在不同时间点的相对表达量数据用余弦分析系统进行余弦分析，发现Bmal1的表达呈规律性(P<0.05)，且振幅为0.28，表达趋势见图4。

表2 不同培养时间点Bmal1的相对表达量

注：以4 h的测量值作为基准 ， *表明基因表达呈规律性，P<0.05

图4 Real Time-PCR检测Bmal1在24 h内不同时间点表达量

3 讨论

Bmal1除了在哺乳类动物下丘脑视交叉上核(SCN)、松果体和视网膜中表达以外，在外周组织，如心脏、肝脏、肾脏、睾丸等组织中也有表达[11-12]。在小鼠妊娠第1-4天子宫、输卵管以及未受精的卵母细胞中可检测到Bmal1的表达，而受精后，Bmal1的表达水平降低，表明该基因在小鼠胚胎早期发育中起到一定的作用[13]。George 等[14]采用免疫组化对小鼠卵巢生物钟蛋白进行表达研究发现，小鼠的卵巢中不仅存在生物钟基因，在不同卵泡期中的表达量也存在差异，表明钟蛋白在卵巢成熟中有着重要的作用。本研究通过免疫荧光对Bmal1在牦牛颗粒细胞中的表达定位，确定了牦牛颗粒细胞中存在Bmal1基因。为后期研究Bmal1基因在牦牛颗粒细胞的功能研究提供理论依据。

哺乳动物的许多生理过程和行为都是有节律的，这些节律是由位于哺乳动物SCN内的内源性分子钟所调控的。SCN作为生物节律的起搏器，通过接收来自外界环境的刺激信号，以体液和神经调节的形式使存在于全身周围组织(如，卵巢等)中的无数辅助振荡器同步，从而调节动物机体的生理及代谢过程[15-16]。哺乳动物生物钟分子模型的核心是节律基因的转录翻译反馈环路，反馈环路中激活因子和抑制因子的相互作用通过转录翻译的正、负反馈调节，使节律基因呈现24 h的节律性变化，从而调节动物机体在24 h内不同时间段的生理代谢[17]。研究认为，卵泡膜细胞是调节动物排卵时间和幅度的重要振荡器，当有条件的对卵泡膜中的Bmal1基因的节律性表达进行干扰，雌性小鼠的排卵发生絮乱[18]。说明生物钟基因在雌性动物生理周期性代谢中发挥着重要作用。Wusu Wang[10]等通过研究猪卵巢颗粒细胞生物钟基因表达情况发现，经地塞米松处理后，在体外培养不同时间点的猪颗粒细胞中，Bmal1和Per2都有着明显的时钟节律性表达。我们通过试验证实了牦牛卵巢颗粒细胞中存在Bmal1基因，并假设该基因在牦牛颗粒细胞中呈一定的规律性表达。本研究利用qRT-PCR技术，检测24 h内不同体外培养时间点牦牛卵巢颗粒细胞中Bmal1基因的表达情况，结果显示，Bmal1的表达呈现一定的规律性，这与Chen[19]等的研究结果一致。这种规律性是动物机体在适应外界环境如：昼夜交替、光照、气温变化等因素而形成的由生物钟基因调控的机制[20-21]。试验表明，牦牛颗粒细胞中存在着近日节律分子机制，根据结果可推测牦牛颗粒细胞中的Bmal1可能通过节律性地调控牦牛卵巢的生物代谢功能。Bmal1基因呈现的表达节律性是否对牦牛颗粒细胞激素分泌和颗粒细胞增殖、凋亡有所影响，还需要进一步研究。

4 结论

本试验结果表明，牦牛颗粒细胞中存在生物钟基因；且Bmal1基因在体外24 h内不同培养时间点的牦牛颗粒细胞中呈规律性表达，说明牦牛卵巢颗粒细胞中存在时钟节律分子机制。试验结果为进一步对牦牛颗粒细胞中的生物节律功能研究提供理论基础。