BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

刘梦瑶 ， 张秋楠 ， 吴文学 ， 李金祥

(1.中国农业大学动物医学院 , 北京 海淀 100193 ； 2.中国农业科学院 ， 北京 海淀 100083)

急性的牛病毒性腹泻和慢性的黏膜病均为牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)引起的包括厌食、胃肠糜烂、腹泻等消化道症状，鼻腔和眼睛排出浆液性分泌液等呼吸道症状和流产、死胎、畸形胎等生殖系统症状的疾病。牛传染性鼻气管炎为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的以脓性鼻分泌物、黏膜充血、结膜炎等上呼吸道的临床症状为主的疾病。这2种传染病均在全球普遍存在，已成为各养牛业发达国家牛场中的主要传染病。BVDV以直接或间接接触方式通过消化道、呼吸道和胎盘传播，IBRV也以接触方式通过眼睛、呼吸道和生殖道传播[1]。在我国牛场，这2种病毒的感染率很高，在鼻拭子、生殖道拭子等组织样中均可能同时存在，因而建立一种能够同时检测这2种病原的qPCR方法，对于临床诊断和流行病学调查具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和菌株 牛支原体PD株及PG45株、牛冠状病毒(BCV)BJ株、牛腺病毒3型(BAV3)SF-4株、牛轮状病毒(BRV)BJ株、牛副流感病毒 3型(BPIV3)WBR-1株、牛病毒性腹泻病毒SZH株、牛传染性鼻气管炎病毒SZH株等临床分离株由本实验室分离、鉴定和保存。牛支原体PG45株购自美国模式菌种收集中心，肠炎沙门菌CVCC3949株、多杀性巴氏杆菌CVCC391株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 主要试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Pre-mixExTaqTM(Probe qPCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；氨苄青霉素、pEASY-T1 克隆质粒、大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)、EasyTaqPCR Mix、TransTaqHiFi PCR Mix I、TransScript cDNA合成Mix等，均购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等，均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 Biometra GmbH Power Cycler SL 96 Gradient常规PCR仪、Light Cycler©96 Real-time PCR仪、ThermoFisher NanoDrop 2000c 全自动核酸微量测定仪。

1.1.4 引物与探针 BVDV的qPCR引物和探针参考文献报道序列(BVDVF：5′-TAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′，BVDVR：5′-GAACCACTGACGACTACCCTGT-3′，BVDV Probe：HEX-CAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT-BHQ2)[2]，IBRV qPCR引物和探针参考文献报道序列(IBRVF：5′-GGGCATCGCCTCGTTTATT-3′，IBRVR：5′-CGTGGTGATCGGGTACAGC-3′，IBRV Probe：FAM-CCCGCCTCCGCAGCAA-MGB)[3]。BVDV PCR引物参考文献报道序列(BVDVF2：5′-ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3′，BVDVR2：5′-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3′)[4]。IBRV PCR引物参考文献报道序列(IBRVF2：5′-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3′，IBRVR2：5′-GCGTCAAAC-TCCTCCTCTTCCTC-3′)[5]。

1.2 方法

1.2.1 阳性质粒的制备 分别获取BVDV的DNA和IBRV的RNA并将BVDV的RNA反转录，PCR扩增相应目的序列。PCR反应体系：BVDVF和BVDVR 0.5 μL或IBRVF和IBRVR 0.5 μL，BVDV的cDNA或IBRV的DNA 2 μL，Mix 12.5 μL、 ddH2O 9.5 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35次；72 ℃ 10 min。产物进行电泳并回收目标条带，与克隆质粒pEASY-T1连接，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3) ，接种有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，取单菌落接种于有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，培养过夜，菌液离心，取沉淀提取质粒，通过PCR和测序鉴定。对BVDV和IBRV阳性质粒进行核酸浓度测量并计算拷贝数。

1.2.2 双重qPCR的优化 分别设定50.0 ℃，50.2 ℃，50.9 ℃，52.0 ℃，53.2 ℃，54.4 ℃，55.6 ℃，56.8 ℃，58.0 ℃，59.1 ℃，59.8 ℃，60.0 ℃ 12个退火温度，采用1.2.1项方法对BVDV或IBRV阳性质粒进行PCR，根据扩增结果确定最适退火温度。分别用0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L或0.5 μmol/L 5种浓度的引物和探针配置20 μL反应体系(含Pre-Mix 10 μL、BVDV和 IBRV模板 2.0 μL)，进行qPCR(95 ℃预热30 s，三步法95 ℃变性 5 s ，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循环45次)，根据Ct值和曲线峰值确定最优引物浓度和探针浓度。

1.2.3 标准曲线的构建 参照海日汗的方法[6]构建阳性质粒拷贝数-Ct值标准曲线。

1.2.4 特异性分析 利用优化的双重qPCR反应体系与反应条件对多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、牛支原体PD株及PG45株、BCV、BRV和BPIV3全基因组cDNA、BAV3和IBRV全基因组DNA、BVDV全基因组RNA和cDNA进行检测，以107拷贝/μL的BVDV和IBRV的阳性质粒DNA作为阳性模板， ddH2O作为阴性对照。

1.2.5 敏感性分析 分别以101、102、103、104、105、106拷贝/μL 的BVDV阳性质粒DNA和10-2、10-1、100、101、102、103拷贝/μL的IBRV阳性质粒为模板，进行双重qPCR，同时采用1.2.1中方法对不同浓度的 BVDV和IBRV阳性质粒溶液进行PCR检测，确定2种方法的最低检测限。

1.2.6 重复性分析 采用双重qPCR方法对107拷贝/μL的BVDV和IBRV阳性质粒溶液进行检测，重复3次，每次设3个重复。采用相同方法对84.5 ng/μL的BVDV和95.3 ng/μL的IBRV核酸进行重复性检测。

1.2.7 临床样品检测 从北京和上海4家牛场采集140份鼻拭子、血清和全血样本。提取核酸，用TransScript First-Strand cDNA Synthesis Super Mix反转录后，进行双重qPCR和PCR检测。

2 结果

2.1 阳性质粒的制备 BVDV和IBRV克隆质粒经PCR扩增和电泳，分别获得了102 bp和148 bp目的条带(图1)，经测序与目的基因序列相符。质粒浓度分别为2.25×1010拷贝/μL和1.47×1010拷贝/μL。

2.2 双重qPCR的优化 根据双重qPCR优化结果(见中插彩版图2)，最适退火温度为54.0 ℃，BVDV引物浓度和探针浓度分别为0.2 μmol/L和0.2 μmol/L，IBRV引物浓度和探针浓度分别为0.3 μmol/L 和0.1μmol/L。

2.3 标准曲线的构建 BVDV和IBRV标准曲线见图3，其斜率分别为-3.119 2、-3.015 9，相关系数分别为0.99、1.00，扩增效率分别为109%、115%，说明标准曲线有良好的线性关系。

2.4 特异性分析 双重qPCR结果显示，BVDV和IBRV的阳性质粒、IBRV全基因组DNA和BVDV的全基因组cDNA均有荧光扩增曲线，多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、牛支原体PD株及PG45株、BVDV的全基因组RNA ，BCV、BRV和BPIV3全基因组cDNA、BAV3全基因组DNA 及ddH2O均无荧光扩增曲线，说明建立的双重qPCR方法有较强的特异性。

图1 BVDV和IBRV阳性质粒的PCR检测结果
M： 低分子量Marker ; 1：BVDV ; 2：IBRV

图2 BVDV和IBRV双重qPCR荧光扩增曲线图
A： BVDV不同引物浓度荧光扩增曲线图 ; B： IBRV不同引物浓度荧光扩增曲线图 ; C： BVDV不同探针浓度荧光扩增曲线图 ;D： IBRV BVDV不同探针浓度荧光扩增曲线图

图3 BVDV和IBRV标准曲线A： BVDV标准曲线; B： IBRV标准曲线

2.5 敏感性分析 双重qPCR结果显示，最低检测限为BVDV 102拷贝/μL、IBRV 100拷贝/μL，PCR的最低检测限为BVDV 103拷贝/μL、IBRV 102拷贝/μL。

2.6 重复性分析 双重qPCR检测结果(见表1)表明，BVDV和IBRV阳性质粒的变异系数分别为1.04%、1.31%，BVDV和IBRV核酸的变异系数分别为1.80%和1.98%。说明该qPCR方法的重复性良好。

2.7 临床样品检测 双重qPCR检测结果(见表2)显示，140份临床样品中BVDV阳性率15.71%、IBRV阳性率12.14%、BVDV+IBRV阳性率5.00%。PCR检测结果显示，140份临床样品的BVDV和IBRV均为阴性。

表1 双重qPCR重复性检测结果

表2 临床样品的BVDV和IBRV阳性率

3 讨论

牛病毒性腹泻及黏膜病普遍流行于养牛业发达的国家，严重阻碍了养牛业的健康发展。Deng等对2010-2013年间采自我国8省1 379头临床健康奶牛、肉牛、牦牛和水牛的血清样品进行了检测，BVDV抗体阳性率58.09% (801/1 379)、病原分离阳性率1.39% (14/1 010)、核酸阳性率22.64%(146/645)，其中奶牛的阳性率分别为89.49% (298/333)、0.00% (0/116)和32.06% (42/131)，基因型为BVDV-1，其中BVDV-1b占33.06%、BVDV-1m占49.19%、BVDV-1u占17.74%[7]。2014年，上海市2个未接种疫苗的规模化奶牛场的BVDV抗体阳性率高达97.4%和96.7%，但病原分离阳性率很低，仅为1.3%[8]。2009-2010年间，爱尔兰305个未免疫奶牛群犊牛的BVDV抗体阳性率为88%(268/305)，其中290日龄左右奶牛的BVDV抗体阳性率为25%[9]。

牛传染性鼻气管炎虽然病死率低，但对牛的生长和产奶量影响很大，这也影响了活牛、奶和乳制品的国际贸易，是养牛业经济损失的重要原因。牛传染性鼻气管炎是世界动物卫生组织(OIE)B类疾病及我国二类动物疫病，也是预防动物疾病及保证国际贸易安全的关键。据调查，2011年我国北方6省市14个未免疫的规模化奶牛场3-5岁泌乳奶牛IBRV抗体阳性率分别为：山东46%(27/59)、河北28%(17/60)、河南86%(43/50)、内蒙古58%(21/36)、新疆68%(82/120)、北京40%(20/50)[10]；2014年，上海市2个未接种疫苗的规模化奶牛场的IBRV抗体阳性率各为41.2%和74.3%[8]；2009-2010年间，爱尔兰305个未免疫奶牛群的犊牛BoHV-1抗体阳性率为80%(244/305)，其中290日龄左右奶牛的BoHV-1抗体阳性率为5.4%[9]；2011年巴西圣保罗州3个奶牛场BoHV-1 抗体阳性率分别为78.6%、40.0%和1.6%[11]。

抗体中和试验、凝集试验、动物接种试验、组织学诊断、细胞培养法、酶联免疫吸附试验等方法皆可用于诊断感染BVDV和IBRV的急性期和潜伏期，但都有灵敏度低、耗时或假阳性等缺点。而PCR方法迅速、操作简便且敏感性、特异性好，能够很好地弥补以上方法的缺点。在我国，牛群经常存在2种病原混合感染(尤其是潜伏感染)，而且这2种病原也都会存在于血液、呼吸道和生殖道等部位，因此建立同时检测这2种病原的方法，无疑会提高检测临床样品的效率。本文利用文献报道的引物及探针序列将BVDV和IBRV特异性探针分别标记上HEX荧光基团和FAM荧光基团，通过优化引物、探针浓度和反应条件，建立了BVDV和IBRV双重qPCR检测方法。BVDV和IBRV的检测限分别达到了102拷贝/μL和100拷贝/μL，BVDV灵敏度与OIE推荐的实时荧光定量检测方法相近[12]，IBRV灵敏度高于OIE推荐的实时荧光定量检测方法[13]、Peili等建立的等温重组酶聚合酶链式反应方法[14]和Marina等建立的高分辨率熔炼实时荧光PCR方法[15]。利用本方法检测多杀性巴氏杆菌、肠道沙门菌、牛支原体、牛冠状病毒、牛腺病毒3型、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型均为阴性，证明该qPCR方法特异性良好。鉴于qPCR方法只能扩增DNA，对血液、血清和鼻拭子样品的RNA和DNA共提取后，进行反转录，结果显示，这种前处理对于双重qPCR方法对BVDV和IBRV的检测均无明显干扰。综上所述，本文建立了同时定量、快速、灵敏地检测出血清、全血和鼻拭子中BVDV和IBRV的双重qPCR方法，在牛场BVDV和IBRV监测和净化工作中具有重要应用价值。