副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

刘国晓 ， 刘 杰 ， 刘维康

(1. 泌阳县中等职业技术学校 ， 河南 泌阳 463700 ; 2.洛阳中科基因检测诊断中心有限公司 ， 河南 洛阳 471000)

副猪嗜血杆菌为猪呼吸道的一种常见细菌，革兰染色为阴性菌，有15个以上的血清型。某些高毒力或中等毒力血清型的副猪嗜血杆菌可引起副猪嗜血杆菌病，又称多发性浆膜炎或格氏病。实验室分离该菌可采集病猪肺脏、关节液、气管黏液、脑组织等病料，分别接种胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)和血琼脂，菌落特点为无色透明、光滑湿润。挑取单菌落进行氧化酶和接触酶试验，结果为氧化酶阴性，接触酶阳性。再加上该菌的常规生化鉴定的结果，可作为快速鉴定副猪嗜血杆菌的初步判断标准，依照此方法可以快速筛选出副猪嗜血杆菌。

1 材料与方法

1.1 病料来源 病死猪来自河南某猪场，病猪出现呼吸困难、消瘦等症状，无菌取肺脏样品。

1.2 主要培养基及试剂 胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，购自青岛海博试剂有限公司；革兰染色试剂， 购自北京索莱宝科技有限公司 ； DNATaq酶、dNTPs、DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离 无菌采取病死猪肺脏，分别接种于血平板和添加血清及辅酶的胰蛋白胨大豆琼脂培养基， 37 ℃厌氧培养24 h，观察菌落形态，挑取单个菌落进行纯化培养，纯化培养后菌株进行革兰染色镜检和常规细菌生化试验。

1.4 细菌鉴定和血清型分型 根据副猪嗜血杆菌16S rRNA基因，张盼峰等[1]设计了1对特异性引物，引物序列为：P1:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′,P2：5′-GTGATGAGGAAGGGTGT-3′,扩增出目的片段大小为821 bp，引物由英潍捷基(北京)有限公司合成。

PCR采用25 μL反应体系，即10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNATaq酶0.5 μL，P1/P2引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 16.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测序。

测序结果用DNASTAR软件处理，并与NCBI中已发表的基因序列进行同源性比较，选取同源性最高菌株的基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN软件进行多重序列比对分析，并构建系统进化树。

副猪嗜血杆菌血清型鉴定，参照Kate J.Howell等[2]报道提供的引物进行合成。

1.5 卫星试验 取1块没有添加辅酶的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，在平板中间直线接种金黄色葡萄球菌，然后将可疑菌落垂直金黄色葡萄球菌线划线接种，37 ℃培养24 h。结果出现靠近金黄色葡萄球菌线的菌落长势较好，远离金黄色葡萄球菌线的地方无菌落生长的卫星现象。

1.6 药敏试验 挑取疑似单个菌落接种于TSA+血清培养基，置于37 ℃恒温摇床中培养5-6 h，取100 μL均匀涂布于含TSA+血清培养基上。用纸片琼脂扩散法(K-B法)[3]进行药敏试验，选取头孢噻呋、阿莫西林、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩诺沙星、卡那霉素、庆大霉素、多西环素和氟苯尼考为试验药物，37 ℃培养16-18 h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株对所选药物的敏感程度。

2 结果

2.1 细菌分离 肺脏样品在平板上的菌落较纯，均为革兰染色阴性杆菌，呈明显的多形性。

2.2 卫星试验 分离株在靠近金黄色葡萄球菌直线处生长较好，而远离直线的地方基本没有细菌生长。

2.3 分子鉴定 取单个纯化且具有典型特点的菌落进行PCR鉴定，并设阳性和阴性对照，阳性对照电泳结果条带大小为820 bp左右，样品条带大小也为820 bp左右，阴性对照无条带，结果见图1和图2，目的菌与Haemophilus parasuis strain CCUG_3712同源性为98.0%，说明该菌株为副猪嗜血杆菌。经鉴定为副猪嗜血杆菌后，取单个菌落进行血清型PCR鉴定，鉴定结果为血清4型。

图1 PCR扩增结果
M:DL-2 000 ； 1:阴性对照 ； 2:阳性对照 ； 3:样品

图2 系统发育树
▲ : 分离毒株

2.4 药敏试验 分离到的细菌对头孢噻呋、甲砜霉素、硫酸黏菌素、阿米卡星、恩诺沙星、卡那霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考高敏；对阿莫西林耐药，如表1。

表1 分离株药敏试验结果

S:敏感；R:耐药

3 讨论

本次实验室细菌分离检测结果为4型副猪嗜血杆菌，在该猪场不同批次和不同圈舍中同样检测到4型副猪嗜血杆菌。细菌的临床检测要对临床症状进行判断，从而发现能够引起此症状的细菌。在养殖场普遍使用抗生素的情况下，对病料的完整性和细菌的分离会有影响。目前实验室细菌初步鉴定的方法主要是革兰染色和选择性平板，最后通过PCR结果进行确定。副猪嗜血杆菌的感染意味猪群的免疫力的下降，这种疫病的发生说明该猪场可能存在免疫抑制性疾病或者管理方面的问题[4]。副猪嗜血杆菌不同的血清型之间对药物的敏感程度存在差异，所以临床用药要根据所分离到的细菌的药敏试验结果来采取有针对性的用药。随着国家对抗生素使用的逐步限制，养殖场对细菌病的防控主要以预防和环境控制为主，细菌病的预防需要对养殖场流行毒株进行了解，细菌病的预防难点是不同血清型的毒株基本没有交叉保护性，需要养殖场建立完善的监控体系，及时更新疫苗毒株。