猪寡腺苷酸合成酶OAS 1a基因荧光定量SYBR Green检测方法的建立与运用

李存法 ， 王瑞宁 ， 李华玮 ， 冯丽丽 ， 张二芹 ， 张 雅 ， 何 健 ， 赵孟孟

(1.河南牧业经济学院制药工程学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2. 河南牧业经济学院生物工程学院 ， 河南 郑州 450046 ；3. 河南省农业科学院农业经济与信息研究所 ， 河南 郑州 450002 ； 4.河南农业大学牧医工程学院 ，河南 郑州 450002 ; 5.佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528000 )

猪繁殖与呼吸综合征是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒引发的一种烈性，高度接触性传染病，临床症状主要是流产、死胎、木乃伊胎以及各种呼吸道症状。该病在我国于1986年首次报道，之后全国流行，2006年暴发，对我国养猪业造成重大损失，已成为养猪业头号危害。由于该病毒是RNA病毒，变异速度快，一直未有有效的疫苗和药物防控该病。

2′,5′-寡腺苷酸合成酶是干扰素刺激产生的一种具有抗病毒活性的干扰素促进基因，最初于1976年报道。病毒感染后产生的IFN能使细胞内2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白量增加上千倍，2′,5′-寡腺苷酸合成酶通过活化RNase L酶引发病毒和细胞的RNA发生降解，从而杀死病毒及其感染的细胞[1-2]。该蛋白在人，猪，牛等多种动物身上都有分布[3-6]。猪寡腺苷酸合成酶家族主要包括OAS1a，OAS1b，OAS2，OASL，其中猪OAS1a有报道具有抗病毒效果[7]，检测OAS1a的表达情况有利于检测机体的免疫特征，为分析机体病毒感染情况，以及免疫调控与免疫逃逸提供参考[8-11]。

针对猪2′,5′-寡腺苷酸合成酶的检测方法一直未见报道，本研究通过荧光定量方法建立一种检测猪OAS1a表达量的方法，为临床检测免疫特征提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞 PAM细胞为农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。

1.2 病毒 PRRSVCH-1R病毒为农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。

1.3 试剂 RNA提取试剂TRIZol，购自Life Technology公司；反转录试剂盒RT reagent Kit；with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、pMD18-T载体、SYBER 荧光定量预混剂，PCRExTaq酶预混剂,购自宝生物工程(大连)有限公司；Poly(I ∶C),购自Invivogen公司;干扰素,购自Pepro-Tech公司;无病原菌猪的脏器：心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、肠为农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。细胞培养用1640和胎牛血清,购自GIBCO公司;含有IRF3、IRF7、 RIG-1的标准质粒为农业部兽用疫苗创制重点实验室保存。

1.4 主要仪器： PCR仪器,购自宝生物工程(大连)有限公司;荧光定量仪器7500，购自ABI公司。

1.5 方法

1.5.1 引物设计 根据猪寡腺苷酸合成酶OAS1a基因的序列设计定量引物，其中上游引物序列为：5′-TATGAATTCAATGGGAAACTGGGGGTCCC-3′，下游引物为：5′-CGCGACGACTCAGTCCATGAATCTCC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 RNA提取与反转录 从PAM细胞以及猪的各种组织提取RNA，RNA提取步骤以及反转录步骤参照试剂盒步骤，具体参照文献[12]。

1.5.3 PCR反应体系ExTaq酶预混剂25 μL，上下游引物(10 pm)各1 μL，模板2 μL，水21 μL，其他具体参照文献[13]。

1.5.4 pMD18-T载体构建 PCR产物经凝胶电泳之后，经过胶回收试剂盒纯化，连接pMD-18-T载体，4 ℃过夜连接，之后转化，挑取单菌落，摇菌，提质粒，具体步骤参照文献[14]。

1.5.5 测序 菌液PCR鉴定阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5.6 病毒感染 PAM细胞以2×105/孔的密度铺在1640培养液中，以MOI=1的病毒剂量感染细胞，分别在不同时间点0 h，6 h，12 h，24 h，36 h，48 h收样，提取RNA，并进行反转录。

1.5.7 干扰素处理 PAM细胞以2×105/孔的密度铺在1640培养液中，以1 000单位干扰素处理细胞，分别在不同时间点0，6，12，24，36，48 h收样，提取RNA，并进行反转录。

1.5.8 不同脏器组织取样 将健康猪的不同组织：心、肝、脾、肺、肾，脑、肠、淋巴结，取样，研磨处理，反复冻融之后提取总RNA，并进行反转录。

1.5.9 荧光定量反应 荧光定量反应体系为10 μL qPCR 预混剂，上下游引物各0.2 μL，模板2 μL，水13 μL，95 ℃ 预变性15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，反应40个循环。

1.5.10 数据处理 所有样品结果与标准曲线对比，计算拷贝数，用GraphPad Prism软件制作图表。

2 结果

2.1 扩增曲线与敏感性结果 将标准质粒换算浓度之后计算拷贝数，倍比稀释之后qPCR反应生成扩增曲线，结果可见曲线平滑，扩增效果良好，结果见图1。敏感性试验结果表明,该试验方法的1 000～1 000 000拷贝数均有扩增，最低拷贝数100无扩增曲线，最低敏感性为100拷贝，结果见图2。

图1 扩增曲线

图2 敏感性试验

2.2 标准曲线结果 在扩增曲线生成之后，仪器自动生成标准曲线，结果见图3，该曲线重合率R2在98.9%，表明曲线重复性良好。

2.3 熔解曲线与特异性结果 qPCR反应结束之后，仪器自动生成熔解曲线，熔解曲线结果可见单峰，表明引物效果良好。将含有IRF3，IRF7， RIG-1 的质粒作为模板进行PCR反应，除了含有OAS1a的目的质粒有扩增曲线以外，其余均未有扩增，表明引物特异性良好。

图3 标准曲线

2.4 组织分布结果 将猪不同组织提取RNA之后进行qPCR反应，结果表明OAS1a基因在多个组织中均有分布，以肝脏和淋巴结最多。

2.5OAS1a在病毒感染过程中表达变化结果 将PRRSV病毒感染细胞，在不同时间点采集细胞，收样，测定拷贝数，结果表明,OAS1a基因在病毒感染过程中表达量逐步升高，36 h达到最高。

图4 OAS 1a基因在不同组织中的分布

图5 OAS 1a基因在PRRSV感染过程中的表达变化

2.6 干扰素处理细胞基因表达变化结果 干扰素处理细胞后，OAS1a基因表达量迅速升高，6 h达到最高，之后有所下降，结果见图6。

图6 OAS 1a基因在干扰素处理过程中的表达变化

干扰素诱导剂Poly(I ∶C)用同样方法处理细胞之后，在4 h诱导期，该基因表达量也迅速升高，结果见图7。

图7 OAS 1a基因在Poly(I ∶C)处理过程中的表达变化

3 讨论

2′,5′-寡腺苷酸合成酶蛋白(2′,5′-Oligoadenylate synthetase protein，OAS)是IFN诱导产生的具有抗病毒活性的一种ISG，该酶家族在IFN抗病毒过程中具有重要作用，同时也参与凋亡及生长等其他细胞行为。病毒感染后产生的IFN能使细胞内OAS蛋白量增加上千倍。在双链RNA(dsRNA)活化后，OAS使ATP寡聚体化生成从二聚体到30聚体不等的2′-5′连接的寡腺苷酸(2-5A)。2-5A与RNase L紧密结合后，使得RNase L形成二聚体而被激活。在病毒感染的细胞中，RNase L引发病毒和细胞的RNA发生降解，从而杀死病毒及其感染的细胞。在人体细胞中，IFN能够诱导产生4种类型的OAS：小型的p42/p46 OAS(OAS1)、中型的p67/p71 OAS(OAS2)、大型的p100 OAS(OAS3)及类OAS蛋白p59(OASL)。小型的OAS也存在于哺乳类动物中，人的p59蛋白(OASL)不具有合成2-5A的活性，鼠DC细胞中也存在同源的OASL蛋白。

在没有IFN的情况下，大多数细胞或组织中OAS的浓度都非常低。在多数情况下，要分离OAS蛋白，就要用IFN对细胞培养物进行处理。2-5A最早出现在1978年，当时它被描述为一种低分子量的蛋白合成抑制剂。之后，在IFN处理的细胞提取物及兔网状细胞裂解液中，合成酶OAS(2-5A Synthetase)及双链RNA依赖的蛋白激酶PKR同时被发现。1987年，Chebath等为2-5A系统(2′-5′-Oligoadenylate system；OAS system)参与IFN抗病毒效应提供了最初的证据。

本试验建立了猪寡腺苷酸合成酶的荧光定量检测方法，为首次报道。该方法简便，特异性好，并检测到该基因在猪不同组织中的分布，证明肝脏和淋巴结中分布较多，原因可能是该组织主要是含有较多的免疫细胞，免疫反应较强烈。另外证明干扰素处理之后，该基因大量表达，进一步证明该基因是干扰素促进基因。另外在PRRSV病毒感染过程中，该基因不断升高，与之前的文献报道一致[15]。不同的是一个是蛋白水平，一个是mRNA水平，原因可能是病毒感染促进了干扰素的表达，干扰素进一步促进该基因的表达，也从侧面进一步证明PRRSV感染可以激活干扰素这个结论。另外，推测其他病毒感染可能也会激活该基因的表达，预计该基因可以作为机体免疫反应被激活的一个证明[16-19]。

已经有报道，其他物种的OAS1a在病毒感染之后都有升高，如Tembusu virus[20]等病毒。在人体上该基因也被作为检测机体免疫特征的检测指标，并且有商品化的ELISA检测试剂盒，但是在动物上还未有报道。

本试验建立的方法为检测猪寡腺苷酸合成酶提供了参考，有利于检测机体的免疫特点。