胃腺癌组织中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达及临床意义

胡乃军,王海龙

锦州医科大学附属第一医院普外科(锦州 121001)

胃癌是胃黏膜呈腺样分化的一种恶性上皮性肿瘤，病变发生最常见的部位是远端胃，即胃窦及幽门区，胃体部肿瘤主要是大弯侧及小弯侧[1]。胃腺癌常伴有淋巴道转移，一般预后较差，与病变形成时的浸润及播散有关[2]。近年研究认为肿瘤细胞播散时可以产生转移相关蛋白[3]。MMPs家族是与转移相关的蛋白，能对细胞外基质成分形成降解，破坏肿瘤转移的屏障，肿瘤细胞易于离开原发灶，形成播散。基质金属蛋白酶-11(MMP-11)和基质金属蛋白酶-12(MMP-12)是近年发现的与转移密切相关的蛋白，两者可能与脉管生成相关[4]。血管内皮生长因子-D(VEGF-D)是血管内皮生长因子家族的新成员，被认为是淋巴管生成的促进因子，通过其受体VEGFR3促进间质淋巴管内皮细胞增殖并介导淋巴管新生[5]。2012年9月至2014年8月我们对胃腺癌术后组织应用流式细胞术检测MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达，分析其相关性及对预后判断的价值。

资料和方法

1 一般资料 纳入研究组的患者均为2012年9月至2014年8月在我院就诊并手术治疗的患者，共130例，纳入标准：①严格按WHO中的标准进行确诊并分型；②均为原发且首次发病。排除标准：①有其它器官恶性肿瘤；②有消化道手术史者。患者年龄51～85岁，中位年龄59岁；男69例，女61例。其中高分化23例，中分化20例，低分化87例；Lauren分型中肠型45例，弥漫型85例。选择上述患者中距肿物边缘大于3 cm的35例非肿瘤性胃黏膜组织作为对照组，年龄55～80岁，中位年龄60岁，男18例，女17例。

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D表达检测 应用流式细胞术检测两组术后新鲜标本中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达。新鲜标本立即取材后应用75%酒精固定24 h以上，用剪刀将组织剪成浆糊状，进行过滤，去除杂质后离心(2000 r/min，10 min)，取沉淀物，制备单细胞悬液(1×106/ml)，取1 ml，严格按实验步骤依条件加一抗、PBS和二抗后，应用美国BD公司生产的流式细胞仪上机检测，应用系统自带的软件进行数据分析。

3 结果判定 实验结果应用荧光指数(FI)表示，FI的计算方法：FI=蛋白表达的荧光强度-对照样品平均荧光强度/正常对照样品平均荧光强度。

4 统计学方法 应用SAS 6.12统计学软件进行处理，依据条件对数据行卡方检验、t检验、方差分析、生存分析和线性相关性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组中MMP-11、MMP-12和VEGF-D表达的比较 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在两组中的表达差别有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 两组中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的比较(FI值)

注：与对照组比较，*P<0.01

2 MMP-11、MMP-12和VEGF-D在研究组不同临床及病理特征分组中的比较 研究组中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达与脉管浸润、Lauren分型和淋巴结转移相关，MMP-11、MMP-12的表达与细胞的增殖指数相关。三者与分化程度无明显相关性。见表2。

表1 MP-11、MMP-12和VEGF-D在研究组不同临床及病理特征分组中的比较

3 MP-11、MMP-12和VEGF-D表达的相关性分析 用线性相关性分析，结果显示MMP-11和VEGF-D(r=0.39，P=0.0313)、MMP-12和VEGF-D(r=0.43，P=0.0213)具有正相关性。

4 MP-11、MMP-12和VEGF-D表达与生存时间的关系 研究组患者随访生存时间8～60个月，平均23.4个月，经生存分析显示MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达与生存时间相关(P<0.05)。即MMP-11、MMP-12和VEGF-D高表达患者生存时间短，预后差；MMP-11、MMP-12和VEGF-D低表达患者生存时间长，预后好。

讨 论

与胃腺癌发生有关的因素包括社会经济状况低下、高盐饮食等，其次胃癌的各种基因谱系如癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因的异常改变也有关，再次与家族遗传倾向也有明显关联[6]。有观点认为幽门螺杆菌感染在胃癌发生的早期阶段可以起到重要作用[7]。分子生物学和免疫化学研究发现胃肿瘤形成和进展有中可以有多种蛋白和基因表达失常，包括微卫星不稳定性、体细胞突变、APC、CyclinE、E-cadherin和nm23等表达异常等。近年流行病学结果显示肠型胃癌的发生率逐年下降，而弥漫型肿瘤却不断增加，这可能与胃镜的广泛应用及时检出早期胃腺癌，使患者进行治疗减少了浸润性胃癌的发生率有关，也可能与弥漫型胃肿瘤在胃镜进行组织活检时易漏诊有关。转移相关基因异常表达是进展期胃腺癌中的分子病理因素[8]。进展期胃腺癌表现为息肉型、蕈伞形、溃疡型或弥漫型。肿瘤镜下形态主要由腺管状、腺泡状或乳头状结构构成，也可以表现为不相粘着的单个细胞构成(弥漫状分布)，肿瘤细胞广泛浸润或隐匿在胃壁的各层，上皮细胞的异型性明显，伴有不同程度的分化。MMP-11和MMP-12是分泌家族转移相关蛋白MMPs家族中的两个重要成员，具有高度保守的锌离子依赖蛋白水解酶[9]。MMP-11主要是经过细胞外的水解后活化，以活性酶的形式存在，能对肿瘤细胞间质的纤维和基质的改建起一定的作用[10]。有研究认为MMP-11能调节血管或淋巴管内皮细胞的生长，促进间质的淋巴细胞聚集和巨噬细胞反应[11]。MMP-12是由活化的炎细胞和恶性肿瘤细胞分泌，白细胞介素、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子及血小板活化因子等均可以介导MMP-12的表达，而MMP-12在正常组织中不表达[12]。MMP-12有广泛的底物活性，能分解弹性蛋白、IV型原和层粘连蛋白，并对肿瘤间质的纤维组织有明显的降解作用[13]。研究显示MMP-12可以对肺纤维化和肺损伤组织的异常重建有明显的促进作用[14]。VEGF-D是新发现的淋巴管生成促进因子，在高迁移肿瘤的进展时，肿瘤细胞可以产生大量的VEGF-D，引起间质中淋巴管内皮细胞的增生，新形成的脉管呈枝芽状生长，在物理性条件作用下，在新生肿瘤的间质处形成管腔，与原淋巴管连接，具有脉管的播散功能，也为肿瘤细胞迁移提供了原始通道[15-16]。

本研究应用流式细胞术检测组织中蛋白的表达，结果可进行半定量分析，客观、可信，说服力强。实验结果显示在研究组中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达明显高于对照组，提示三者具有癌基因样的作用，MMP-11、MMP-12和VEGF-D是肿瘤形成和进展中的重要促进蛋白。研究组中MMP-11、MMP-12和VEGF-D的表达与脉管浸润、Lauren分型和淋巴结转移相关，提示三者是与肿瘤迁移和播散相关的重要蛋白。MMP-11和MMP-12的表达与细胞的增殖指数相关，提示二者具有促进肿瘤细胞增生和繁殖的作用。由于以上因素均为与患者生存时间(预后)相关的临床及病理指标，因此三者高表达可能与患者的生存时间或预后相关，而预后分析直接证实了此结论。研究组中MMP-11和VEGF-D、MMP-12和VEGF-D的表达具有正相关性，提示MMP-11和MMP-12均可以促进VEGF-D的表达[17]，诱导淋巴管生成。但是MMP-11和MMP-12在血管生成调节过程中的通路作用可能不确切。MMP-11、MMP-12在肿瘤进展期中的表达升高，即随着肿瘤进展MMP-11和MMP-12分泌增加，引起肿瘤细胞生长和分化，细胞异型性明显，增殖活跃，并能对P53和ras等基因进行调控，促进肿瘤细胞的迁移和播散[18-19]。MMP-12具有多种生物学功能，通过识别ECM及细胞膜上免疫蛋白超家族粘附分子、细胞间粘附分子等介导肿瘤细胞的粘附作用，并引起细胞信号传导异常及调节细胞生存和增殖[20-21]。MMP-11在腺上皮恶性转变过程中还可能通过对WNT和PI3K的信号通路进行调节起作用，由于MMP-11本身是一种分泌蛋白，其产生后不仅在细胞质中表达，还可以分泌到细胞外液体环境中，即在血液和组织液中可以检测MMP-11的表达，因此血清中可以检测出MMP-11的表达，其与组织中的表达可能有一定的一致性[22]。VEGF-D被认为可能与MMP-11和MMP-12有协同作用的因子，MMP-11和MMP-12可能是上游基因，调节着VEGF-D/VEGFR3等信号通路，引起细胞增殖和迁移，但是它们是否能作为淋巴管生成的直接通路有待更多实验证实。

总之，MMP-11、MMP-12和VEGF-D在胃腺癌中的表达上调，且具有正相关性，三者对病变的形成和进展意义明显，联合检测三者的表达对判断预后可能有一定价值。