长链非编码RNA-POU3F3在胶质瘤中表达及影响预后的相关因素研究

于庆伟,秦彦昌,张百平,罗国强

空军军医大学第二附属医院神经外科(西安710038)

胶质瘤是中枢神经系统中最常见和恶性程度最高的原发性肿瘤[1]。胶质瘤的预后较差，尤其是胶质母细胞瘤，其中位存活期仅12～15月，患者术后1年和5年生存率分别为低于20%和5%[2-3]。因此，寻找特定的适合于胶质瘤早期诊断、治疗以及判断预后的新的生物标志物，对于探索更有效的治疗方法具有重要的意义。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)，是一类长度大于200个核苷酸，无蛋白质编码功能的RNA[4]。近年来的研究发现，许多lncRNA在很多疾病的生物学过程中发挥着重要作用，特别是在癌症[5]。此外，研究还观察到lncRNA在肿瘤组织中异常表达，可作为肿瘤早期诊断、治疗和预测预后的生物学标志物。例如，研究证实，转移相关肺腺癌转录1 (MALAT1) 在肺癌组织中表达水平显著增高，MALAT1过表达组患者的预后较差[6]。也有研究发现，lncRNA ZEB1-AS1可以促进胶质瘤的发生并可预测患者的不良预后[7]。高表达的SNHG20可预测结肠直肠癌患者的预后不佳[8]，等等。这些研究结合在一起, 为lncRNA在肿瘤发生和进展中的潜在作用提供了证据和支持。研究发现，lncRNA-POU3F3在人类的多种正常组织和肿瘤组织中均有表达[9]。在多种恶性肿瘤组织中，POU3F3表达水平会发生异常，如食管鳞状细胞癌[10]、结直肠癌[11]、肝癌[12]、胃癌[13]、胶质瘤[14]等。但目前关于POU3F3对胶质瘤患者临床预后的影响却鲜有报道。鉴于此，为了探索POU3F3在胶质瘤组织中的表达水平及其对胶质瘤患者的临床意义，本课题组分析了65例胶质瘤患者术中切除的肿瘤组织标本及25例正常脑组织标本中POU3F3的表达量，对POU3F3的表达水平与患者的生存率的关系进行统计分析，以及探讨其是否是胶质瘤患者不良临床预后的独立危险因素。

对象与方法

1 研究对象 从2008年9月至2013年9月在空军军医大学唐都医院神经外科接受手术切除的患者中采集了65例胶质瘤患者的术中切除的组织标本，其中男性39例、女性26例，平均年龄为49.8岁；根据WHO分级：I级11例，II级15例，III级22例，IV级17例。以25例同期采集的行癫痫或外伤手术内减压患者的正常脑组织为对照。曾接受放射治疗、化疗、手术和其他抗肿瘤治疗的患者除外。根据世界卫生组织(WHO)的分类，通过病理检查对胶质瘤标本进行疾病诊断和等级分类。肿瘤及正常标本经液氮快速冷冻，切除后立即保存在-80°C处。本研究经空军军医大学唐都医院伦理委员会批准。所做的工作符合规定。所有患者均获得书面知情同意。

2 研究方法 用Trizol 法 (Invitrogen, CA, USA)从组织样品中提取总RNA。取 1 μl上述组织总RNA,按照逆转录试剂盒说明将 RNA 逆转录为Cdna,应用 qRT-PCR法分别检测神经胶质瘤组织和正常脑组织标本中POU3F3的表达水平，内参基因设置为GAPDH。引物及探针序列如下：POU3F3上游引物正向: 5’-AATCACTGCAATTGAAGGAAAAA-3’,下游引物反向: 5’-CCTTGTTTTCCAACCCTTAGACT-3’, GAPDH上游引物正向: 5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’,下游引物反向: 5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。采用法2-△△ct对qRT-PCR的检测结果进行分析，所有的实验重复3次以上。

3 随 访 对参与研究的患者进行为期5年的随访, 随访为门诊复诊或进行电话随访的形式，统计患者从最初的手术开始到最后死亡的日期，并计算患者整体的存活率，随访截止时间为2018年9月。其中因意外事故或因与胶质瘤无关的原因而死亡的患者被排除。

结 果

1 神经胶质瘤组织中POU3F3表达水平 采用qRT-PCR技术检测65例胶质瘤组织和25例正常脑组织中POU3F3的表达水平。按照 WHO(2007年)神经系统肿瘤分类的标准对选取的肿瘤组织标本进行组织学分级：I～II级26例，III～IV级39例。检测结果显示，与正常脑组织相比，POU3F3在胶质瘤组织中表现出较高的表达水平[正常脑组织(1.000±0.277)与胶质瘤组织(3.164±0.307),P=0.0004)]。同时通过数据对比，POU3F3的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增高而增高[WHO I～II级(2.427±0.309)与 WHO III～IV级(3.902±0.316)，P=0.008]，说明POU3F3的表达水平与胶质瘤的恶性程度呈正相关(图1)。

图1 LncRNA-POU3F3在正常脑组织和不同级别神经胶质瘤中的表达水平

2 POU3F3表达水平在胶质瘤患者中的作用以及对患者预后的影响 利用 Kaplan-Meier分析法进行POU3F3表达水平与患者生存率的关系分析并进行Log-rank试验。在65例胶质瘤患者中, 以POU3F3在胶质瘤组织样本中的表达水平平均值为界值将神经胶质瘤患者分成高POU3F3表达组(n=38)和低表达组(n=27),结果显示POU3F3表达与胶质瘤患者整体生存率成反比，POU3F3低表达的患者总存活率明显高于POU3F3高表达的患者，即高水平的POU3F3表达可能预示着患者整体生存率水平的下降(P=0.029)(图2)。

图2 LncRNA-POU3F3高表达组和低表达组患者术后5年生存率比较

3 胶质瘤患者临床病理变量与生存率的单因素和多因素分析 Cox回归分析显示POU3F3过表达(HR=2.443, 95% CI: 1.299～4.742,P=0.015)、组织学分级(HR=2.668, 95% CI: 1.489～5.290,P=0.003)、KPS评分<80分(HR=2.703, 95% CI: 1.498～5.268,P=0.001)以及术后复发(HR=2.510, 95% CI: 1.335～5.125,P=0.008)是影响胶质瘤预后的主要因素。此外，与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤数目等无关(P>0.05)。见表1。

表1 胶质瘤患者临床病理变量与生存率的单因素和多因素分析

注：KPS：卡氏行为状态评分；HR：风险比；CI：置信区间

讨 论

到目前为止，已经鉴定出3000个lncRNA，但是其中只有少数几个lncRNA功能被很好地证实[15]。越来越多的研究提示某些异常表达的lncRNA可以调节肿瘤的形成和进展[16-18]。关于后一种效应，某些lncRNA的表达已经被证明与多种癌症的复发、转移和预后有关[19-21]。因此，研究lncRNA的作用可能是一个关于致癌和抑癌研究谜题中缺失的重要片段。

胶质瘤是一种复杂的神经胶质细胞的恶性肿瘤，尽管近年来基础和临床研究取得了一定的进展，但与胶质瘤发病机制有关的分子机制以及如何改善不良预后仍存在诸多问题[22-23]。lncRNA-POU3F3属于长链非编码RNA的一种，之前的研究学者发现lncRNA-POU3F3在多种恶性肿瘤组织中的表达水平显著上调，是一种潜在的致癌lncRNA。例如，Li等[24]人的研究团队发现，在食管鳞癌组织和细胞中，lncRNA-POU3F3表达水平明显增高，高表达的lncRNA-POU3F3促进了食管鳞癌细胞DNA甲基化，进而影响肿瘤的进展。也有研究发现，与正常肝组织和正常肝细胞系相比，肝细胞癌组织和细胞系中lncRNA-POU3F3水平显著升高，lncRNA-POU3F3水平与临床分期、肿瘤大小、血管浸润转移呈正相关；此外，lncRNA-POU3F3的高表达是肝癌患者预后的独立因素，lncRNA-POU3F3在肝癌中作为一种致癌基因，为肝癌患者提供了一种潜在的治疗策略[25]。值得注意的是，也有研究报道lncRNA-POU3F3在胶质瘤发生发展中的作用。例如，研究证实lncRNA-POU3F3在胶质瘤组织和细胞中水平上调，且与胶质瘤的恶性程度显著相关[26]。但目前关于胶质瘤患者组织中POU3F3的表达水平对胶质瘤术后患者预后的影响却未有研究报道。

本研究检测了胶质瘤中POU3F3的表达水平，我们发现，相比较于正常脑组织，POU3F3在胶质瘤组织中呈高水平表达，此结果与先前的文献报道一致；与此同时，分析数据显示POU3F3的表达水平与胶质瘤的病理分级呈正相关，提示其可能与胶质瘤组织的恶性程度密切相关。随后，本课题组进一步探讨了POU3F3表达与术后患者整体生存率的关系。通过随访分析，发现POU3F3在患者中的表达水平与患者预后有显著相关性，POU3F3高表达患者术后5年生存率明显下降，表明其可能与胶质瘤患者的术后进展有密切关系。更重要的是, 通过Cox回归分析提供证据表明, 高表达水平的POU3F3、高病理级别以及KPS评分<80分均是影响患者术后预后的重要原因，这提示我们POU3F3可以影响胶质瘤的进展，可作为影响胶质瘤患者预后的独立危险因素。

综上所述，lncRNA-POU3F3可能在胶质瘤进展过程中发挥重要作用，过表达的POU3F3是影响患者预后的重要指标。本研究为胶质瘤靶向治疗提供了理论依据，POU3F3在胶质瘤过表达导致的不良预后的具体作用机制，将是我们下一步实验进行的方向。