丙酮酸乙酯对百草枯中毒导致急性肺损伤大鼠高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4表达的影响

徐道剑，卢 翔，赵长海，盛 琦

(台州市立医院 急诊科，浙江 台州 318000)

百草枯(paraquat，PQ)是一种有效的除草剂，被广泛应用于农业除草中[1]。人体一旦吸收百草枯可造成弥漫性肺损伤，进一步可发展为不可逆的肺纤维化，甚至呼吸衰竭[2]。百草枯的中毒机制尚未明确[3]，有研究报道[4]，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)与Toll样受体4(TLR-4)可与肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子相互作用而导致肺损伤。而丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)可对炎症因子产生一定的抑制作用[5]。本研究拟分析EP对HMGB1、TLR-4和炎症因子表达水平的影响，旨在探讨EP治疗PQ中毒的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用SD雄性大鼠141只，随机分为PQ组、EP组及对照组各47只。SD大鼠由台州市立医院实验室提供。大鼠饲养温度为20～26℃，环境湿度为40%～60%，每日开箱30 min。PQ组大鼠周龄8～10周、平均9.83±1.56周，平均体重236.54±3.21 g；EP组周龄9～11周、平均9.83±1.56周，平均体重246.54±5.04 g；对照组周龄10～12周、平均11.88±1.83周，平均体重187.3246.28 g。三组大鼠平均周龄、平均体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 处理方法 20%的PQ水剂以40 mg/kg PQ的剂量对PQ组和EP组大鼠灌胃，建立百草枯中毒大鼠模型[5]。EP溶于乳酸钠林格液，于PQ灌胃0.5 h后，以40mg/kg EP的剂量对EP组大鼠进行腹腔注射。PQ组与对照组腹腔注射与EP组等量的生理盐水。三组大鼠分别在腹腔注射后6 h、12 h、24 h和48 h时，每次各随机取4只大鼠，采用10%的水合氯醛溶液进行注射麻醉，分离颈外静脉，抽取静脉血，静置后离心取血清；分离肺组织放置于RNA safetyTM组织RNA保存液(上海索宝生物科技有限公司)中保存。

1.3 观察指标 取4 mL大鼠颈外静脉血，进行离心操作后取血清，采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)含量。采用RT-PCR法检测大鼠肺组织中的HMGB1、TLR-4、白细胞介素-1(IL-1)及TNF-α的mRNA相对表达量。RT-PCR反应条件为：预变性95℃ 30 s；PCR反应95℃ 5 s，60℃ 30 s，共计40个循环。2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织mRNA表达量比较 腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ组和EP组大鼠的肺组织TNF-α mRNA、HGMB1 mRNA、IL-1 mRNA、TLR-4 mRNA的表达量均高于对照组，EP组的TNF-α mRNA、HGMB1 mRNA、IL-1 mRNA、TLR-4 mRNA的表达量均低于PQ组，差异均有统计学意义(P<0.05)；见表1。

表1 三组大鼠肺组织mRNA表达量比较

注：*与PQ组比较，P<0.05；#与对照组比较，P<0.05；下同。

2.2 血清MDA和SOD含量比较 腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ组和EP组大鼠血清的MDA含量均高于对照组，EP组的MDA含量低于PQ组，差异均有统计学意义(P<0.05)；腹腔注射后6 h、12 h、24 h及48 h，PQ组和EP组大鼠血清的SOD含量均低于对照组，EP组的SOD含量均高于PQ组，差异均有统计学意义(P<0.05)；见表2。

表2 三组大鼠血清MDA和SOD含量比较

3 讨论

PQ中毒可对患者各个组织器官造成极大的损伤，尤其是对肺部的损伤，一般表现为肺充血、肺水肿等[6-8]，呼吸衰竭可造成患者死亡[9-10]。研究认为[11]，氧化应激、脂质过氧化反应及免疫炎症级联反应在PQ中毒所导致的肺纤维化进展中起着重要的作用。PQ可通过激活Clare细胞、I和II型肺泡上皮细胞的聚胺转运体选择性地在肺内浓聚，氧化应激反应是PQ中毒致肺纤维化的主要起始机制之一，PQ进入肺组织后会被还原成分子基团PQ+，PQ+被氧化后形成超氧阴离子，通过SOD的歧化作用转化为过氧化氢，最终过氧化氢通过各种作用破坏正常肺组织[12]。氧化应激过程中产生的活性氧类可与细胞膜的多不饱和脂肪酸发生反应，最终形成过氧化物，脂质过氧化物将破坏肺组织细胞膜结构。SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，其含量高低反映了机体清除自由基和抗脂质过氧化能力，MDA是常见的脂质过氧化的最终产物，可反映脂质氧化所产生的活性氧水平[13]。

本研究结果显示，与对照组比较，百草枯中毒后不同时间点的PQ组大鼠MDA含量均明显上升，SOD含量均明显下降，提示PQ中毒后的大鼠肺组织氧化应激反应明显，产生较多的氧自由基，脂质过氧反应剧烈而导致MDA增多。HMGB1为真核生物普遍存在的高度保守的核蛋白，可激活炎性细胞炎症部位的聚集，有助于促进炎性细胞分泌大量的炎性因子，造成组织损伤[14]。TLR-4是HMGB1介导细胞因子的必需蛋白，TLR-4也可与TNF-α、IL-1等炎性因子相互作用，进一步加剧机体组织损伤。本研究结果显示，与对照组比较，百草枯中毒后PQ组大鼠肺组织的HMGB1 mRNA、TLR-4 mRNA、TNF-α mRNA、IL-1 mRNA的表达量显著上升，提示大鼠HMGB1、IL-1、TNF-α、TLR-4均参与了PQ中毒导致的急性肺损伤的免疫炎性级联反应。

EP可有效抑制炎症因子，并减少后期炎性因子释放，具有显著的抗氧化效应[15]。本研究结果显示，丙酮酸组的HMGB1 mRNA、TLR-4 mRNA、TNF-α mRNA、IL-1mRNA表达量显著低于百草组，且MDA含量显著低于百草组，SOD的活性水平显著高于百草组(均P<0.05)，提示EP可控制大鼠百草枯中毒后的肺组织氧化应激反应、免疫炎性级联反应，减轻急性肺损伤程度。

综上所述，百草枯中毒所致急性肺损伤可能与免疫炎症和氧化应激损伤有关，而丙酮酸乙酯可以通过改善氧化应激损伤和炎症减轻百草枯中毒所致急性肺损伤。