Annexin A7在高癌家系鼻咽癌人群中的表达水平*

唐浩斌, 邓太海, 谷婷婷， 陈舒华△

1广东医科大学研究生学院(广东湛江 524000); 2赣南医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科(江西赣州 341000); 3佛山市第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科(广东佛山 528000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是源于鼻咽部的恶性肿瘤，是我国广东地区的高发癌症[1]，男性年龄标准化发病率(ASR)为30/10万，女性ASR为13/10万，远超世界其他地区(ASR<1/10万)[2]，具有明显的地域性，早有学者提出地域性的基础源于家族的遗传性，可追溯至先秦时期的百越先民[3]。而近数十年的研究也不断证实了家族史与EB病毒一样，与鼻咽癌具有强相关性[4-7]。在鼻咽癌高发区，鼻咽癌患者的一级亲属是高危人群[8-9]。因此，鼻咽癌高癌家系患者的早期诊断以及对高癌家系患者的一级亲属的早期筛查显得尤为重要。本研究组曾对鼻咽癌高癌家系患者的外周血及病理组织进行MALDI-TOF-MS初筛，发现膜连蛋白A7(Annexin A7)出现异常表达[10]。Annexin A7是钙离子依赖磷脂结合蛋白多基因家族的一员，与细胞膜运输、细胞信号转导、细胞分化和增殖、转移有关[11]，在前列腺癌、消化道肿瘤、乳腺癌中均有明显的异常表达[12]。但Annexin A7和高癌家系鼻咽癌患者存在何种关系，此前鲜有报道。因此检测Annexin A7在鼻咽癌高癌家系癌患者中的表达情况，初步揭示两者之间的关系，并且对以后我们寻找高度特异性的鼻咽癌肿瘤分子标记物提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有的鼻咽组织标本均取自佛山市第二人民医院耳鼻喉科2009年7—10月门诊患者，其中高癌家系鼻咽癌组织15例、散发性鼻咽癌组织15例、鼻咽黏膜慢性炎症患者鼻咽组织15例。这些患者均有完整的临床及病理资料，在30例鼻咽癌标本中，男17例，女13例，根据鼻咽癌2008分期[13]进行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例，有淋巴结转移16例，无淋巴结转移14例。年龄在20～78岁之间。取出鼻咽组织迅速放入冻存管中，液氮速冻后，置-80℃超低温冰箱保存。

1.2 检测材料 RT-PCR试剂盒、Trizol试剂盒、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗等购于北京鼎国生物技术公司。小鼠抗人Annexin A7抗体、β-actin抗体购于美国Sant Cruz公司。

1.3 RT-PCR检测Annexin A7与α-enolase mRNA的表达 按照Trizol试剂盒说明对标本进行总RNA的抽提。提取后进行取部分进行电泳，在紫外透射仪上观察，确认提取RNA的完整性及质量。同时使用紫外分光光度计上测定A260/A280比值，确保DNA没有污染。确保提取RNA可用后运用逆转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，反应体系：随机引物1 μL，dNTPs 1 μL，5×RT buffer 4 μL，酶混合液1 μL，目的RNA 3 μL，DEPC-ddH2O 10 μL，总体积为20 μL。反应条件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 1～5 min。取cDNA进行进行PCR定量扩增，反应体系：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 38 μL，总体积50 μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，引物57℃退火30 s，72℃延伸40 s，一共完成35个循环，最后72℃延伸5 min。以β-actin为内参照，计算目的基因的相对基因量。

引物由上海生工生物工程技术公司设计合成。具体如下：Annexin A7基因引物序列：上游引物5′-GGGAAATCGTGATGAGAACCAG-3′,下游引物5′-GCCCACAATAGCCAGAAGAAG-3′,扩增片段长度321 bp；β-actin基因引物序列：上游引物 5′-CACCAAATGGGACGACAT-3′,下游引物5′-ACAGCCTGGATAGCAACG-3′，扩增长度189 bp。

1.4 Western blot检测Annexin A7蛋白的表达 将标本组织裂解提取蛋白质，通过BCA法测定蛋白质浓度。取100 μg蛋白样品行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，分离后转至PVDF膜上，通过一抗[鼠抗人AnnexinA7单克隆抗体及β-actin抗体(内参照)]和二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)反应，最后经过DAB显色剂显色。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 在高癌家系鼻咽癌组、散发性鼻咽癌组及鼻咽黏膜慢性炎症组中Annexin A7 mRNA的表达量依次为0.828±0.046、0.459±0.048、0.312±0.072,3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，并且组间两两比较结果差异有统计学意义(P<0.05)。Annexin A7 mRNA在高癌家系鼻咽癌组织及散发鼻咽癌组织中表达均有上调，其中高癌家系显著上调(图1)。

*P<0.05

2.2 Western blot蛋白免疫印迹结果 在高癌家系鼻咽癌组、散发性鼻咽癌组及鼻咽黏膜慢性炎症组鼻咽组织中Annexin A7相对密度值依次为0.867±0.068、0.624±0.065、0.392±0.087，3组间比较结果差异有统计学意义(P<0.05)，并且组间两两比较结果差异有统计学意义(P<0.05)，在高癌家系鼻咽癌组织中表达显著上调(图2)。而且Annexin A7蛋白在鼻咽癌组织中的表达与TNM分期及淋巴结转移有关，与患者的年龄﹑性别无关。Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中表达高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

*P<0.05

临床因素例数Annexin A7蛋白表达t值P值分期2.3730.025 Ⅰ～Ⅱ期120.676±0.036 Ⅲ～Ⅳ期180.792±0.031淋巴结转移3.0510.005 有160.810±0.032 无140.672±0.032性别0.7940.434 男170.764±0.035 女130.722±0.037年龄0.3880.701 ≤40岁160.736±0.033 >40岁140.756±0.041

3 讨论

Annexin A7最早被发现于1978年[14]，其基因定位于人类染色体10q21.1～21.2，有47 kD和51 kD两种亚型[15]，受蛋白激酶调节钙离子依赖性GTP酶的控制，通过介导Ca2+/GTP信号通路在细胞外膜发挥作用[11]。Annexin A7在肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色。Srivastava等[12]发现Annexin A7在人肝癌组织中高表达。Bai等[16]的研究表明Annexin A7协同Bcl-2影响肝癌的细胞凋亡过程。而Ye等[17]的研究则揭示Annexin A7参与了胃癌细胞的凋亡，同时其蛋白表达水平也与胃癌细胞的分化程度及淋巴结转移情况相关[18]。Torosyan等[19]的研究发现了Annexin A7能够抑制激素敏感型的前列腺癌细胞的增殖，提示其在前列腺癌中可能发挥着抑癌基因的作用。早在2004年，Srivastava等[20]就发现Annexin A7在乳腺癌组织中高表达，而近期Huang等[21]的研究也提示着Annexin A7的表达水平与乳腺癌患者的预后密切相关。而本研究组前期研究也发现鼻咽癌患者的外周血中Annexin A7存在高表达。

本次研究，鼻咽癌高癌家系患者及散发性鼻咽癌患者组织中的Annexin A7在mRNA及蛋白水平上均出现了高表达，与鼻咽慢性炎症患者组织的低表达水平存在显著性差异(P<0.05)，这表明Annexin A7在基因转录水平和蛋白质翻译水平的表达是一致，这提示该蛋白为鼻咽癌的差异性表达蛋白，进一步证实了本课题组前期研究的成果[10]。Annexin A7在鼻咽癌组织中的高表达，与其在乳腺癌组织中的表达相似[20-21]，这提示其可能作为癌基因而影响鼻咽癌的发生和发展的。结合Ji等[22]的研究结果可以推测Annexin A7在高癌家系鼻咽癌患者中的高表达，可能激活了Ras-Raf-MAPK通路，使癌细胞异常的生长、增殖及分化，从而影响癌细胞的发生发展。但是，Annexin A7在不同的肿瘤中发挥着不同的作用，既有扮演癌基因角色的[12]，也有以抑癌基因出现的[19]，目前其如何在鼻咽癌中产生作用依然没有确切定论，因此，Annexin A7在高癌家系鼻咽癌中发挥着怎样的功能与机制我们还需进一步研究。

另一方面，本研究中，Annexin A7在鼻咽癌高癌家系及散发性鼻咽癌两组患者中的表达存在显著性差异，在基因转录及蛋白翻译层面，高癌家系患者的Annexin A7表达均明显高于散发性患者。既往研究[4-7]已表明家族史为鼻咽癌的相关性因素，具有鼻咽癌家族史的正常人更容易出现鼻咽癌，这提示易感人群的鼻咽组织中癌基因处于略高水平的活跃状态。因此，结合本研究组对F-肌动蛋白α亚基[23]、陈舒华等[24]的研究结果后，我们推测，鼻咽癌高癌家系成员本身的Annexin A7及其他生物标志物已处在略高于正常人的表达水平，导致其发病后表达水平进一步升高。反推过来，通过这个差异，我们可以在众多鼻咽癌患者中发现高癌家系患者，进而可以对高癌家系成员进行早期的筛查，这对高癌家系患者一级亲属的鼻咽癌筛查和干预有着重要的价值。

此外，本研究结果也发现Annexin A7蛋白在Ⅲ～Ⅳ期的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中表达高于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)，这与杨民正等[25]得出的结果相符。由此看出，Annexin A7和鼻咽癌的发展过程密切相关，它可以在一定程度反映鼻咽癌恶性程度和浸润转移程度。这提示我们检测Annexin A7的表达情况可以评估鼻咽癌的严重程度和恶性程度。

综上所述，本研究通过分析鼻咽癌高癌家系患者、散发性鼻咽癌患者及鼻咽慢性炎症患者的鼻咽组织中的Annexin A7表达水平，推测Annexin A7参与了鼻咽癌发生、发展的过程，并发挥了重要作用。有介于此，Annexin A7有望成为鼻咽癌患者早期评估，特别是高癌家系患者及其近亲的早期筛查的指标之一。同时，Annexin A7的表达和肿瘤的分期和淋巴结转移有关，也可作为评估肿瘤疾病的严重程度和恶性程度的指标，从而指导肿瘤疾病的治疗。