子宫内膜癌组织中CD169+巨噬细胞浸润密度与临床特征及预后的关系*

黄丽华, 卢雪珍, 黄琼华

汕头潮南民生医院妇产科(广东汕头 515144)

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是妇科最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率具有增加的趋势，是世界范围内女性群体中发病率第6高的肿瘤[1]。子宫内膜癌大多数早期治疗的患者可以得到有效的控制，其中手术方式包括全子宫切除术和双侧输卵管切除术、系统的盆腔/腹主动脉淋巴结清扫[2]。尽管如此，对于进展期子宫内膜癌的治疗效果仍然较差，目前多采用放疗和辅助性化疗的治疗方法[3]。目前肿瘤免疫治疗已经成为肿瘤治疗的新策略，研究[4]表明高密度瘤内CD8+T细胞浸润的子宫内膜癌患者具有更好的临床预后。且目前多种针对CD8+T细胞的免疫治疗也正在临床试验中，但目前的免疫治疗仍具有很大的限制，进一步明确子宫内膜癌中具体的免疫调控微环境对肿瘤的免疫调控和治疗具有重要意义。淋巴结是控制免疫原性抗原免疫反应的最初器官之一，在抗肿瘤免疫环境下，各种恶性肿瘤的局部淋巴结被认为是免疫系统与肿瘤细胞或其产物接触的第一个部位，碎片化的肿瘤细胞可以转移流入淋巴窦，其中窦CD169+巨噬细胞内化，加工和呈递MHC Ⅰ复合物上的抗原，诱导肿瘤抗原特异性T细胞活化[5]。研究[6]表明CD169+巨噬细胞在局部淋巴结中是参与抗肿瘤免疫反应的关键组成部分。淋巴结窦中的巨噬细胞特异性表达跨膜受体CD169，也称为唾液酸黏附素或唾液酸结合凝集素(Siglec)-1。CD169结合唾液酸化糖蛋白，包括CD43和MUC1，并且参与介导细胞与细胞之间的黏附作用和细胞与病原体之间的相互作用。进一步研究[7]显示CD169+巨噬细胞具有促炎的功能，并介导了T细胞和NK细胞的活化。但对于CD169+巨噬细胞在子宫内膜癌中的作用仍未明确。本研究旨在探讨宫内膜癌组织中CD169+巨噬细胞浸润密度与及对临床预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年7月至2016年1月于我院行治疗的子宫内膜癌患者共83例，纳入标准：(1)经病理诊断为子宫内膜癌；(2)获得患者知情同意；(3)病历资料完整并获得随访的患者；排除标准：(1)合并类风湿关节炎或全身免疫性疾病的患者；(2)合并其他肿瘤的患者。本研究向医院伦理委员会审批并获得批准。83例子宫内膜癌患者，年龄36～76岁，平均(57.3±9.3)岁。其中子宫内膜癌FIGO分期为Ⅰ期46例，Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期共12例。

1.2 免疫组化检测方法 将手术切除下的子宫内膜癌组织常规地固定在10%中性缓冲甲醛溶液中，然后采用石蜡包埋。对石蜡进行3 μm厚度连续切片后，每个病例取2张切片。切片按常规脱蜡，3%H2O2处理10 min，蒸馏水洗3次，每次2 min。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98℃之间并持续10～15 min。取出容器，室温冷却10～20 min。然后在含 0.025% Triton Ⅹ-100 的 TBS 溶液中洗涤载片2次，每次 5 min。使用含10% 正常血清及 1% BSA 的 TBS 溶液室温封闭 2 h。1% BSA 的 TBS 溶液稀释一抗(CD68兔单克隆抗体，#76437，CST；CD169/Anti-Sialoadhesin, ab228293, abcam)，加一抗4℃ 下孵育过夜。含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液中洗涤载片两次，每次 5 min。使用含 1% BSA 的 TBS 溶液稀释二抗，并将酶偶联二抗涂覆于载片上然后在室温下孵育 1 h，在室温下用显色底物显色约 10 min，冲洗后采用苏木精复染，放置后以进行光学显微镜检查。

1.3 免疫组化评定 对每个病例的CD169和CD68切片随机选择5个视野，高倍镜视野下(×200)对CD169和CD68阳性的细胞进行计数，具体阳性的细胞采用Image J软件分析，通过5个视野中CD169和CD68阳性的细胞进行计数取平均值；根据83例患者中CD169和CD68阳性的细胞数中，取计数的中位值作为cut-off值，分为高密度和低密度，其中CD169≥70个/高倍镜为高密度，CD169<70个/高倍镜为低密度；取CD169/CD68的密度比0.8为cut-off值，CD169/CD68≥0.8为高密度比，CD169/ CD68<0.8为低密度比。

1.4 临床资料收集和随访 记录所有患者的年龄、患者经期情况，肿瘤FIGO分期、病理资料情况，包括病理分级、肌层浸润深度、血管浸润和淋巴结转移情况。患者术后至少每3个月复诊1次，记录所有患者的随访和预后情况。

2 结果

2.1 CD169和CD68巨噬细胞在EC中的浸润情况 83例子宫内膜癌组织中，CD169+巨噬细胞平均为(69.4±16.2)个/高倍镜，其中高浸润密度(≥70个/高倍镜)共42例，低浸润密度(<70个/高倍镜)共41例；CD68+巨噬细胞平均(82.3±22.7)个/高倍镜，CD169/ CD68为高密度比的共46例，低密度比共37例。见图1。

A、B 分别为CD169阳性巨噬细胞在子宫内膜癌组织中低密度浸润和高密度浸润；C、D分别为CD68阳性巨噬细胞在子宫内膜癌组织中低密度浸润和高密度浸润

图1CD169和CD68阳性巨噬细胞在EC组织中的浸润情况(免疫组化，×200)

2.2 CD169+巨噬细胞及CD169/CD68密度比与子宫内膜癌临床特征的关系 其中CD169+巨噬细胞在子宫内膜癌中的浸润密度与CD169/CD68在子宫内膜癌中的密度比与子宫内膜癌的临床分期、淋巴结转移密切相关，临床分期为Ⅰ期的患者其CD169+巨噬细胞高浸润密度和CD169/CD68高密度比患者的比例显著高于Ⅱ～Ⅳ期，淋巴结转移阴性患者其CD169+巨噬细胞高浸润密度和CD169/CD68高密度比患者的比例显著高于淋巴结转移阳性，差异均有统计学意义(P<0.05)，而不同年龄、病理分级、肌层浸润深度、血管浸润、是否绝经的患者其子宫内膜癌中CD169+巨噬细胞和CD169/CD68密度比比例差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 CD169+巨噬细胞及CD169/CD68密度比与EC临床特征的关系 例

2.3 CD169+巨噬细胞及CD169/CD68密度比与子宫内膜癌临床预后的关系 所有患者随访时间为6～36个月，中位随访时间为27个月，其中子宫内膜癌组织CD169 巨噬细胞高密度患者的总体生存率为80.13%，CD169 巨噬细胞低密度总体生存率为53.95%，CD169 巨噬细胞高密度的总体生存率显著优于CD169 巨噬细胞低密度的患者，差异有统计学意义(HR=0.366，95%CI：0.160～0.838，P=0.017 5)；子宫内膜癌组织CD169/CD68高密度比患者的总体生存率为83.31%，CD169/CD68低密度比总体生存率为50.63%，CD169/CD68高密度比患者的总体生存率显著优于CD169/ CD68低密度比的患者，差异有统计学意义(HR=0.302，95%CI：0.132～0.692，P=0.004 7)，见图2。

A:CD169;B:CD169/CD68

3 讨论

子宫内膜癌是最常见的女性恶性肿瘤，但其中肿瘤相关巨噬细胞在子宫内膜癌中具体的机制仍需要进一步深入研究。带有不同表面标记物的肿瘤相关巨噬细胞其功能不同，既往研究[8]表明，直肠癌或黑色素瘤患者中CD169+巨噬细胞在肿瘤组织高密度浸润能获得更好的临床预后，且CD169+巨噬细胞的浸润水平与CD8+T细胞浸润密度呈正相关。虽然有部分研究[9]显示局部淋巴结中CD169+巨噬细胞的密度并不一定是总生存的独立危险因素，但有更多的CD169+巨噬细胞和CD169和CD68+巨噬细胞的比例增加也显示了能获得更好的预后[10]，表明了CD169+巨噬细胞在不同的肿瘤甚至不同的个体中发挥的功能存在一定的差异。本研究结果显示子宫内膜癌组织中CD169+巨噬细胞浸润密度和CD169/CD68密度比与患者的临床分期，淋巴结转移以及临床预后均具有密切的关系。

既往研究[11]显示,CD169+巨噬细胞与自然杀伤(NK)细胞具有密切的关系。NK细胞也存在于多种肿瘤微环境中，被认为参与机体对恶性肿瘤的免疫应答，临床前研究[12]表明， NK细胞有效地杀死几乎任何来源的循环肿瘤细胞，但杀死肿瘤外浸润的肿瘤细胞的能力取决于NK细胞的活化水平。Garcia等[13]研究显示，CD169+巨噬细胞在吞噬病毒颗粒后促进了NK细胞的积聚和活化。Coombes等[14]研究表明，具有炎性功能的CD169+巨噬细胞是淋巴结窦区NK细胞活化的关键调控细胞。尽管CD169+巨噬细胞介导的NK细胞活化的完整机制尚不清楚。本研究显示了CD169+巨噬细胞高密度浸润，淋巴结转移的患者更少，且低临床分期患者的比例更多，表明了CD169+巨噬细胞对子宫内膜癌中局部淋巴结转移具有一定的抑制作用。其具体发挥的机制可能是通过活化NK细胞介导免疫应答相关，具体可能是通过CD169+巨噬细胞分泌IFN-α发挥作用。但本研究并未进一步检测NK细胞的浸润情况，具体的关系仍需要进一步通过临床病例组织确认。

CD169+巨噬细胞也可能通过其他机制促成抗癌免疫。调节性T细胞(Treg)在其表面上表达CD169配体，允许其与CD169+巨噬细胞相互作用，其通过CD169+巨噬细胞介导的Treg抑制促进炎症作用[15]。因此，CD169+巨噬细胞可能抑制局部淋巴结中的Treg细胞从而增强抗癌免疫。此外，肿瘤组织中的CD8+淋巴细胞是发挥促进抗癌作用的关键[16]，CD169+巨噬细胞具有抑制Treg细胞的功能，既往也有研究[17]显示CD169+巨噬细胞与CD8T细胞浸润密度密切相关，因此，在子宫内膜癌组织中进一步评估CD169+细胞与CD8 T细胞浸润之间的相关性具有重要意义。

综上所述，本研究结果显示了CD169相关巨噬细胞在子宫内膜癌中与临床分期及淋巴结转移密切相关， CD169+巨噬细胞高密度浸润的子宫内膜癌患者具有更好的临床预后。表明了子宫内膜癌组织中CD169相关巨噬细胞浸润是子宫内膜癌患者临床预后和介导子宫内膜癌免疫治疗的潜在靶标。