Fascin-1在肝内胆管细胞癌中的表达及意义

苏宝威， 白明辉， 刘海潮

郑州大学附属洛阳中心医院肝胆外科(河南洛阳 471009)

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)一般指发生在肝脏二级胆管及以上的胆道上皮恶性肿瘤，属原发性肝癌的一种，发病率约占原发性肝癌的10%～15%[1]，仅次于肝细胞癌，是第二大原发性肝恶性肿瘤[2]，其组织病理分型以腺癌常见，肿瘤大体观可分为肿块型、管内生长型及管周浸润型，又以肿块型常见[3]，ICC发病率地域间存在明显差异，但在全球范围内其发病率及病死率均呈上升趋势[4]。目前手术切除仍是ICC的首选治疗方案[5]，但ICC发病隐匿，早期无明显症状[6]，缺乏特异性的早期诊断肿瘤标志物，且其恶性程度高，确诊时大多都有肝内或淋巴转移，即使是手术切除，术后5年生存率仅为20%～40%，且ICC对传统的化疗、放疗都不敏感，疗效较差[7]，因此能否早期诊断ICC就尤为重要，近年来，人们通过大量研究ICC的生物学标志物，期望能为早期诊断ICC并改善其预后提供帮助[8-9]。Fascin-1已被证实在多种上皮来源恶性肿瘤如食管癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌等中发挥作用[10]，但目前鲜见有Fascin-1与ICC的研究。本研究试图分析ICC中Fascin-1的表达情况，并对患者进行随访来了解其与ICC发生发展的关系及对患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月至2018年1月的ICC标本(58例)和正常肝内胆管组织标本(43例)，标本蜡块由郑州大学附属洛阳市中心医院病理科提供，58例肝内胆管细胞癌中男28例，女30例；中位年龄56.9岁(30～85岁)。病理分级：高分化癌23例，中分化癌21例，低分化癌14例，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期22例，无门脉受侵46例，门脉受侵12例，淋巴结转移19例，无淋巴结转移39例，有脏器转移14例，无脏器转移44例，乙型肝炎(乙肝)病毒携带34例，无乙肝组24例。所有标本纳入标准为：ICC患者均无肿瘤病史，术前未接受化疗、放疗及生物治疗等，其病历资料完整可查。选取的同期正常胆管上皮组织(胆管结石和胆道损伤时手术切除的胆管组织)43例作为对照组，所有患者均签署知情同意书。试剂选择：美国Cell Signaling Technology公司生产：鼠抗人 Fascin-1单克隆抗体，福州迈新生物技术开发有限公司：免疫组化试剂盒、PBS缓冲液，抗原修复液和DAB显色试剂。郑州大学附属洛阳中心医院中心实验室及病理科提供其他试剂及设备。

1.2 免疫组化SP法 蜡块切片后常规脱蜡水化，修复抗原，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶后加入山羊血清封闭抗原，加一抗过夜，复温后加羊抗兔IgG，DAB显色，苏木素复染，脱水后封片，整个过程严格按免疫组化试剂盒说明进行，用血管内皮细胞中Fascin-1的表达为阳性对照，阴性对照则用PBS溶液代替一抗。

1.3 结果判定 由经验丰富病理科医师采用双人双盲阅片，Fascin-1阳性反应物质ICC中呈棕褐色或(和)棕黄色，主要定位为细胞质中，参照黄英等[11]阳性细胞计数与染色强度相结合的二级计分法对 Fascin-1蛋白阳性表达结果进行判定。着色强度据反应物颜色分为四级，依次计0～3分，阳性细胞所占百分比分为五级，依次计0～4分，两者相乘为最终结果，小于4分为阴性， 4分为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件，采用2检验分析Fascin-1在ICC和正常胆管上皮组织中的表达及其与ICC临床病理指标的关系。采用Kaplan-Meier法对生存曲线进行描述，并对Fascin-1蛋白表达阳性及阴性患者的生存差异进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fascin-1在ICC及正常肝内胆管组织中的表达 Fascin-1主要表达于细胞质中，阳性颗粒棕黄色至棕褐色分布，见图1。58例ICC组织中Fascin-1蛋白表达阳性29例，阳性率高达55.2%，而在正常肝内胆管组织中不表达，差异有统计学意义(2=34.727，P<0.05)，见表1。

A:Fascin-1在ICC中的表达;B:Fascin-1在正常肝内胆管组织中的表达

图1 免疫组化检测Fascin-1蛋白的表达(SP,×400)

2.2 Fascin-1表达与ICC临床病理指标的关系 不同年龄、性别、是否合并乙肝分组ICC患者ICC组织中Fascin-1阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。ICC TNM分期：Fascin-1蛋白阳性率Ⅰ～Ⅱ期38.9%，Ⅲ～Ⅳ期81.8%；组织分化：Fascin-1蛋白阳性率高分化组26.1%，中低分化组74.3%；淋巴结转移：Fascin-1蛋白阳性率无淋巴结转移组35.9%，淋巴结转移组94.7%；门静脉受侵：Fascin-1蛋白阳性率无门脉侵犯组35.9%，门脉侵犯组83.3%，脏器转移组：Fascin-1蛋白阳性率无脏器转移组45.5%，脏器转移组85.7%，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Fascin-1表达与ICC临床病理指标的关系 例

2.3 生存分析 采用Kaplan-Meier方法统计分析示：58例ICC患者的中位生存时间为22个月，Fascin-1蛋白阴性组的ICC患者中位生存时间为30个月，Fascin-1蛋白阳性组的ICC患者中位生存时间为12个月(图2)。Fascin-1蛋白阳性表达的ICC患者的预后明显差于阴性表达患者(P=0.007)。

3 讨论

Fascin蛋白最早发现于海胆母细胞胞质中，目前认为其是一种细胞骨架蛋白，分子量55×103，包含493个氨基酸残基，其编码基因全长13 852 bp，位于7p22，有5个外显子，其成熟mRNA长度为2 812 bp[10]。现研究表明，Fascin蛋白能与F-actin蛋白结合，故又叫肌动蛋白结合蛋白，人们发现其与 传统肌动蛋白结合蛋白同源性较差，所以将其归纳为一类新型的肌动蛋白结合蛋白家族(Fascin蛋白家族)。现人类已知的Fascin蛋白有3种：Fascin-1存在于大多数脊椎动物细胞中，Fascin-2仅在视网膜中表达，Fascin-3则仅在睾丸组织中表达，目前对Fascin-1蛋白研究较多。肿瘤的转移复发是现在恶性肿瘤治疗的难题，而肿瘤的转移首先要突破基底层，研究表明[12]Fascin-1与F-actin蛋白结合可改变细胞膜的结构，从而增加细胞迁移、转移的能力。

图2 Fascin-1蛋白表达与生存时间相关性分析

本研究试图通过检测Fascin-1在ICC组织中的表达,探讨其与临床病理参数的关系，结果发现58例ICC组织中Fascin-1呈阳性表达的有32例，阳性率高达55.2%，而在正常肝内胆管组织中Fascin-1不表达，差异有统计学意义，提示Fascin-1与ICC的发生过程有一定关联。Fascin-1在中低分化癌组织中的表达(74.3%)显著高于其在高分化癌组织中的表达(26.1%)，差异有统计学意义，因此笔者推测Fascin-1与ICC的恶性生物学行为有关。此外Fascin-1蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组高于Ⅰ～Ⅱ期组，且在门脉受侵组、有淋巴结转移组和合并脏器转移组的表达均显著高于其对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示其可能与ICC的侵袭转移能力有关。而Fascin-1在ICC组织中的表达与患者的性别、年龄及是否合并乙肝等无统计学意义,这与Fascin-1在肺癌和结直肠癌[13-14]中的表达一致。据生存分析显示，Fascin-1蛋白表达阳性组患者预后明显比阴性组差，这与既往文献[15-17]报道大致符合。刘迪生等[18]研究Fascin-1蛋白对肿瘤细胞的影响是通过细胞内外信号途径共同作用，当细胞外基质中纤维连接蛋白集结并激活GTP酶及PKCα，进一步使Fascin蛋白ser-39位点磷酸化，并促使活化的PKCα与该位点结合，进而导致含Fascin蛋白的细胞表面与侵袭移动相关的丝状伪足、微棘和微突显著变短或减少，致使细胞移动侵袭能力明显增强。李恩民等[10]研究则认为，转录因子Sp1激活食管癌细胞Fascin基因启动子核心元件，使EGF/EGFR/ERK1/2信号通路活化，磷酸化的Sp1进一步激活Fascin基因转录，导致Fascin蛋白表达异常,该研究还指出，Fascin蛋白或其mRNA的过表达发生在食管癌早期，并伴随肿瘤的发生发展过程，可作为临床诊断的早期预警标志。Mao等[19]研究指出,Fascin可能通过调节Wnt /β-Catenin信号诱导胆管癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，该研究显示沉默Fascin后β-catenin发生磷酸化并在细胞核中的浓度降低，敲减Fascin后导致QBC939细胞膜中β-catenin 和E-cadherin表达上调，其具体机制还有待进一步研究。当然，影响ICC的发生、发展、浸润及转移的因素非常复杂，Fascin-1只是其中之一。

综上所述，Fascin-1与ICC的发生、发展及侵袭等密切相关，但Fascin-1对肿瘤调控的机制非常复杂，具体还需进一步研究。近年来，在肿瘤生物学领域，Fascin蛋白已被人熟知，尤其是在细胞骨架肿瘤生物学这一新的分支领域中，Fascin蛋白更是受人青睐，随着对其进一步的研究，相信其一定会在肿瘤领域中发挥重要的作用。