Apelin-13对人巨噬细胞极化的影响*

孙梦娜， 徐予△， 刘洪智， 岳凤阳， 郝家亮， 陈昌， 孙志阔， 张春丽

1郑州大学人民医院(河南省人民医院)心血管内科(河南郑州 450003)； 2阜外华中心血管病医院心内科(河南郑州 450018)

Apelin是1998年发现的G蛋白耦联受体APJ的内源性配体，广泛存在于机体多种器官，如心、肺、肾、肝、脂肪组织、胃肠道、脑、肾上腺、内皮、血浆等。Apelin-13是含有13个氨基酸的短肽，是人体血液中常见的Apelin亚型之一，具有较强的生物活性，其在外周组织和中枢系统中均有表达。已有研究显示Apelin-13参与机体多个系统的病理生理过程，具有调控细胞增殖、自噬、氧化应激和凋亡的作用，故Apelin-13的研究具有一定的临床意义[1-2]。而巨噬细胞可以在不同的刺激条件下分化为经典的促炎亚群M1型或选择性的抗炎亚群M2型。M1型巨噬细胞主要分泌促炎细胞因子，比如白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，表达CD86、CD16/32等[3]。M2亚型为选择性激活亚型，其作用与M1亚型相反，主要以分泌IL-10，表达CD206为主。有研究显示Apelin可通过调节核因子-κB(NF-κB)/JNK通路的基础机制抑制炎症，在缺氧条件下，Apelin可保护巨噬细胞免受凋亡，并可增强细胞迁移[4]，该结论具有一定的临床意义。本研究旨在探讨不同浓度Apelin-13对THP-1来源的人巨噬细胞极化的影响,其具有一定的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验于2017年12月至2018年5月在郑州大学人民医院中心实验室完成。人单核细胞THP-1购自中国科学院干细胞库(引进于American Type Culture Collection ATCC)。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶均购自Solarbio公司，体积分数 10% 胎牛血清 (fetal calf serum，FCS) 购自Gibco公司，佛波酯(PMA)和脂多糖(LPS) 购自 Sigma 公司，重组人γ干扰素(IFN-γ) 购自 Peprotech 公司，Apelin-13购自Cayman公司，抗体 FITC CD86 和 PE CD206 购自EXBIO公司，人转化生长因子-β1(TGF-β1)、人IL-1β、人TNF-α、人IL-6、人IL-10、人IL-4 ELISA 试剂盒购自欣博盛公司。

1.2 方法

1.2.1 人巨噬细胞的体外诱导 人单核细胞THP-1复苏后加入5 mL含10%FCS的RPMI 1640培养基(包含青霉素1 000 U/mL、链霉素100 mg/mL和谷氨酰胺2 mmol/L)后转移至25 cm2细胞培养瓶中，在37℃，5%CO2培养箱中培养，每2～3 d换液传代。待THP-1细胞状态良好时离心去除培养基，用PMA 50 ng/mL刺激培养THP-1，并接种在6孔板中，用加入体积分数10% FCS的RPMI 1640培养基培养48 h，获得未分化巨噬细胞(M0)[5];参照Martinez等[6]的方法将M0 进一步诱导，采用IFN-γ 20 ng/mL和LPS 200 ng/mL刺激培养48 h，诱导出M1型巨噬细胞，流式细胞仪鉴定细胞表型后进行下一步实验。

1.2.2 不同浓度Apelin-13干预诱导后的巨噬细胞 将生长状态良好的诱导后的M1型人巨噬细胞胰蛋白酶处理后以5×104/孔浓度接种于12孔培养板上。贴壁生长6 h后，分别添加不同终浓度(100、500、1 000 ng/mL)的药物Apelin-13(分别为低浓度组、中浓度组、高浓度组)，未添加药物干预的人巨噬细胞组设为空白对照组，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养48 h。

1.3 细胞膜蛋白表达的流式细胞仪检测 分别收集THP-1来源经 PMA+IFN-γ+LPS 诱导刺激48 h的贴壁细胞及Apelin-13干预后的贴壁巨噬细胞，调整至每管1×106，PBS洗1次，50 μL鞘液重悬，加入PE CD206 及FITC CD86， 避光室温孵育30 min， 鞘液洗2遍，再用鞘液500 μL 重悬后用 BD FACS Calibur 流式细胞仪检测。根据实验分组，未与抗体作用的巨噬细胞作为阴性对照。

1.4 ELISA检测细胞因子分泌 分别收集对照组及不同浓度Apelin-13干预组的细胞培养上清。按照试剂盒说明操作, 将标准品及上述收集的培养上清加入相应孔内，100 μL/孔，37℃孵育90 min，洗板5次,分别加入生物素标记人的 IL-6/TNF-α/IL-4/IL-10/TGF-β1/ IL-1β 抗体稀释液及工作液(100 μL/孔)，37℃孵育60 min; 洗板5次，分别加入酶结合物稀释液及工作液(100 μL/孔)，37℃ 避光孵育30 min; 洗板5次，加入TMB显色工作液(100 μL/孔)，37℃避光孵育 15 min;加入终止液(100 μL/孔)，测定450 nm的吸光度(OD450)值。

2 结果

2.1 THP-1细胞来源的巨噬细胞的诱导和鉴定结果 THP-1细胞呈类圆形，悬浮生长(图1-A)，经PMA+IFN-γ+LPS诱导后细胞形态逐渐变不规则，胞体增大，细胞表面伸出伪足，呈树突状、梭状及放射状，6 h开始逐渐贴壁，24 h基本贴壁，48 h后完全贴壁生长成巨噬细胞(M1,图1-B)。流式细胞仪检测显示M1型巨噬细胞分化比例达到92%以上，适用于后续试验。

2.2 M1型巨噬细胞细胞因子分泌水平的检测 通过ELISA法检测了空白对照组及不同浓度Apelin-13干预组中巨噬细胞几种细胞因子的分泌水平(OD450值), 结果如表1所示, 与空白对照组相比，不同浓度Apelin-13干预组中巨噬细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平明显降低(P<0.05)，且随Apelin-13干预浓度升高，细胞因子分泌量逐渐减少，但中浓度组与低浓度组相比，细胞因子IL-1β的分泌量减少不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；低浓度组与空白对照组相比，细胞因子TNF-α的分泌量减少不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。而TGF-β1、IL-10、IL-4的分泌增加，尤其 TGF-β1分泌水平明显增加(P<0.01)，且呈Apelin-13浓度依赖性，但中浓度组与低浓度组相比，细胞因子IL-10、TGF-β1的分泌量增加不明显，差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 M1型巨噬细胞表面分子表达的检测 对已报道M1型巨噬细胞的标志CD86和M2型巨噬细胞的标志CD206的表达进行了FACS检测，结果如表2所示， Apelin-13干预后巨噬细胞表面CD86的表达阳性率较空白对照组显著降低(P=0.000)，CD206的表达阳性率较空白对照组有显著增加(P=0.000), 由低浓度组至高浓度组，CD86的阳性率逐渐减低，但中浓度组较低浓度组略有减低，差异无统计学意义(P=0.077)，而CD206的阳性率依次增加，但高浓度组较中浓度组略有增加，差异无统计学意义(P=0.058)。

A: 未诱导的THP-1细胞; B:诱导刺激后的M1细胞

项目空白对照组低浓度组中浓度组高浓度组IL-61.704±0.0041.314±0.0070.880±0.0070.478±0.003IL-1β2.154±0.0031.594±0.0081.588±0.0020.931±0.004TNF-α1.374±0.0031.368±0.0030.665±0.0080.249±0.004IL-100.077±0.0020.106±0.0030.111±0.0040.168±0.002IL-40.068±0.0030.080±0.0020.110±0.0020.165±0.004TGF-β10.068±0.0020.093±0.0040.100±0.0020.244±0.009

项目空白对照组低浓度组中浓度组高浓度组CD8683.633±0.75121.400±0.40020.467±0.58614.733±0.451CD20612.067±1.73965.967±0.66676.133±1.00278.134±0.657

3 讨论

巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，M1型与M2型分属两个极端[7]，M1型巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等以及驱化因子参与正向免疫，发挥免疫监视功能；M2型巨噬细胞通过分泌抑制性细胞因子IL-10 、TGF-1β 、IL-4等对免疫应答进行负向调节[8]。

有研究报道巨噬细胞不具有APJ受体，且不能对Apelin产生反应[9-10],而本研究发现:与空白对照组相比，随药物Apelin-13浓度的增加，Apelin-13干预组中棒状、放射状以及树枝状形态的巨噬细胞逐渐减少，细胞变圆，黏附性增强，细胞内颗粒增多；且流式细胞术鉴定发现巨噬细胞表面标志CD206阳性率依次增加，巨噬细胞表面标志CD86均为阴性(表2)。说明Apelin可以抑制M1型巨噬细胞的活性，进一步促进M1型巨噬细胞向抗炎M2型分化，进而导致IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子表达降低，TGF-1β、 IL-10、IL-4等抗炎因子表达增加(表1)。已有文献报道Apelin-13可以通过抑制巨噬细胞来源的脂蛋白脂肪酶(LPL)，从而减少脂质积累以及促炎细胞因子分泌,如IL-6、IL-1β、TNF-α[11-12]，该结论与本研究结果吻合，表明Apelin-13其在机体免疫反应调节中起一定作用。巨噬细胞可借 Toll 样受体4(TLR4) 或 IL-1 信号激活 IκB 激酶(IKK) 复合物，通过 TLR2/核因子 κB(NF-κB) 关键炎症信号通路调节巨噬细胞的 M1型活化[13-15]， 而Apelin可抑制NF-κB /JNK信号通路，降低磷酸化NF-κB和磷酸化JNK的表达[4]。因此，这一机制可能是Apelin-13影响M1型巨噬细胞活性的原因。但本研究的一个局限性是没有进行拮抗实验，因此不能证实Apelin-13的应用与Apelin/APJ系统直接相关。

综上所述，Apelin-13可以促进THP-1来源巨噬细胞由M1型向M2型分化，抑制M1型巨噬细胞分泌促炎细胞因子，促进抗炎细胞因子分泌。且细胞因子的分泌与Apelin-13呈一定的浓度依赖性。