血管紧张素Ⅱ固相合成工艺研究

江锡铭 黄龙 黄臻辉

摘 要 采用Fmoc固相合成法合成血管紧张素Ⅱ，通过采用高替代度Fmoc-Phe-Wang树脂作为固相载体、FmocArg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA与Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶联体系、三氟乙酸/三异丙基硅烷/水裂解体系等措施，提高了合成工艺的经济性、安全性、易操作性和生产效率，且所得产品粗品的纯度高达93.5%。

关键词 血管紧张素Ⅱ 固相合成 高替代度树脂

中图分类号：O629.72； TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）07-0069-02

Process study on solid-phase synthesis of angiotensinⅡ

JIANG Ximing， HUANG Long， HUANG Zhenhui*

（SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Solid-phase synthesis of angiotensinⅡwas performed by taking high degree of substitution Fmoc-PheWang resin as a solid carrier， both Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA and Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC as coupling system， trifluoroacetic acid/triisopropylsilane/water as hydrolysis system and other measures so as to improve the efficiency， safety and operability of the synthesis process and the production efficiency， and the purity of angiotensinⅡcrude product could reach to as high as 93.5%.

KEY WORDS angiotensinⅡ； solid-phase synthesis； resin of high substitution

血管緊张素Ⅱ（angiotensinⅡ， AngⅡ）是八肽类物质，氨基酸序列为Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe，临床上用作急救用升压药物。AngⅡ能特异性地升高血压和增加周围血管阻力，通过支配血管平滑肌感受器而致血管收缩，升压效能较一般的拟交感神经胺类药物（如去甲肾上腺素、新福林、间羟胺、恢压敏等）强，且无组织坏死、影响肾功能之严重副作用[1]。本研究参考相关文献[2-5]，建立了AngⅡ的新固相合成工艺。

1 材料和试剂

Wang树脂（替代度1.23 mmol/g），天津南开和成科技有限公司生产；保护氨基酸（Fmoc-AA-OH）、二异丙基碳二亚胺（DIC）、苯并三氮唑-N， N， N′， N′-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、二异丙基乙胺（DIPEA）、三异丙基硅烷（TIS）和4-二甲氨基吡啶（DMAP），均吉尔生化（上海）有限公司生产；三氟乙酸、色谱乙腈，均美国Tedia有限公司生产；哌啶，国药集团化学试剂有限公司生产；N， N′-二甲基甲酰胺（DMF）、吡啶、醋酐、二氯甲烷、甲醇，均上海凌峰化学试剂有限公司生产。

2 AngⅡ的固相合成

在HOBt/DIC/DMAP的催化作用下，Fmoc-Phe-OH的羧基端与固相载体Wang树脂的羟基端共价结合[6]，形成Fmoc-Phe-Wang树脂。其后，以该树脂上氨基酸的氨基作为反应活性位点，逐一偶联脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、天冬酰胺，得到多肽树脂。将多肽链从多肽树脂上切割下来，脱除氨基酸侧链保护基，即得AngⅡ粗品。

2.1 Fmoc-Phe-Wang树脂制备

称取Wang树脂50 g（100 ～ 200目），置于多肽合成仪中，用500 ml DMF洗涤、抽干，再用500 ml二氯甲烷溶胀、抽干。加入Fmoc-Phe-OH 71.5 g、HOBt 24.9 g、DIC 28.9 ml、DMF 300 ml、二氯甲烷100 ml，利用氮气流将反应系统迅速降温至16 ℃，然后缓慢加入DMAP1.5 g，26 ℃下搅拌18 h。抽干，用DMF洗涤、抽干。加入吡啶49 ml、醋酐58 ml、二氯甲烷500 ml，27 ℃下搅拌3 h。抽干。用DMF、甲醇交叉洗涤，抽干，真空干燥至恒重，得Fmoc-Phe-Wang树脂75 g（60 mmol），测得其替代度为0.80 mmol/g。

2.2 Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂制备

在用500 ml DMF溶胀2次、抽干后的Fmoc-PheWang树脂中，加入含20%哌啶的DMF溶液500 ml，25 ℃下搅拌脱Fmoc保护2次（第1次10 min，第2次20 min），然后依次用DMF洗涤1次、甲醇洗涤2次、DMF洗涤1次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。加入FmocPro-OH 40.5 g、HOBt 16.2 g、HBTU 45.5 g、DMF 350 ml、二氯甲烷100 ml，利用氮气流将反应系统迅速降温至15 ℃，再滴加DIPEA 31.4 ml，25 ℃下搅拌2.5 h，茚三酮检测呈阴性后抽干，用甲醇洗涤1次、DMF洗涤2次，抽干，得Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂。

2.3 Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-ProPhe-Wang树脂制备

参照Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂制备步骤，先后进行在含20%哌啶的DMF溶液中的脱Fmoc保护，DMF、甲醇、DMF、二氯甲烷交叉洗涤，与Fmoc-AA-OH偶联等操作，其中偶联体系依次为：①Fmoc-His（Trt）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA；②Fmoc-Val-OH/HBTU/HOBt/DIPEA；③Fmoc-Tyr（tBu）-OH/HBTU/HOBt/DIPEA；④Fmoc-Val-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA；⑤Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/HOBt/ DIPEA和Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用；⑥Boc-AsnOH/HOBt/DIC。偶聯条件为（25±3）℃下搅拌2 ～ 3 h，茚三酮检测呈阴性为反应终点。与Boc-Asn-OH偶联完成后，依次用甲醇、DMF、甲醇交叉洗涤，抽干至恒重，得Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-PheWang树脂157.4 g。

2.4 AngⅡ制备

按三氟乙酸∶TIS∶水=95∶2.5∶2.5（V/V/V）配制裂解液1.6 L，搅拌下加入Boc-Asn-Arg（Pbf）-ValTyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-Phe-Wang树脂157.4 g，26 ℃下搅拌2.5 h。过滤，滤液通过减压蒸馏浓缩，然后加入冷甲基叔丁基醚沉淀，经离心处理、洗涤、抽干，得AngⅡ粗品70.5 g。

3 讨论

3.1 Fmoc-Phe-Wang树脂替代度的选择

高载量树脂适用于规模化生产，能节减物料成本、提高生产效率。在本研究中，我们曾使用不同替代度的Fmoc-Phe-Wang树脂来合成AngⅡ。考虑到AngⅡ是由8个氨基酸组成的多肽，所以最初选择的Fmoc-PheWang树脂替代度为0.50 mmol/g。此外，考虑到AngⅡ固相合成中须使用Fmoc-Arg（Pbf）-OH，其侧链保护基2， 2， 4， 6， 7-五甲二氢苯并呋喃-5-磺酰基（Pbf）的空间位阻过大，影响偶联效率，故采取了加大Fmoc-Arg（Pbf）-OH用量、延长偶联时间等措施。实验中选择的FmocPhe-Wang树脂替代度最大达0.86 mmol/g，最后所得AngⅡ粗品的品质良好。

3.2 偶联体系的选择

偶联体系的选择在多肽固相合成中非常关键，适宜的偶联体系可大大提高多肽产品的纯度和收率。例如，本研究经实验发现，采用Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HBTU/ HOBt/DIPEA偶联体系所得多肽产品的纯度为86.79%，主要杂质含量为6.62%，而采用Fmoc-Arg（Pbf）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA和Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶联体系所得多肽产品的纯度为93.53%，主要杂质含量为1.74%，品质明显更优。

3.3 裂解条件的选择

本研究对Boc-Asn-Arg（Pbf）-Val-Tyr（tBu）-Val-His（Trt）-Pro-Phe-Wang树脂的裂解条件进行了多方面的研究，并经实验证明：采用三氟乙酸/TIS/水和三氟乙酸/TIS/乙二硫醇/水裂解体系所得AngⅡ粗品的品质无明显差异；低温4 ～ 10 ℃下裂解16 ～ 20 h和常温（25±3）℃下裂解2 ～ 3 h所得AngⅡ粗品的品质无明显差异。常温裂解工艺更为简便，更为环保，更适宜于大规模生产。

4 小结

我们采用Fmoc固相合成法合成AngⅡ，并在具体合成过程中通过采用高载量树脂、Fmoc-Arg（Pbf）-OH/ HBTU/HOBt/DIPEA与Fmoc-Arg（Pbf）-OH/HOBt/DIC并用偶联体系、摒弃了有恶臭味的乙二硫醇的裂解体系等措施，提高了合成工艺的经济性、安全性、易操作性和生产效率，且所得AngⅡ粗品的纯度高达93.5%。对AngⅡ粗品再进行成盐反应和后处理等操作，即可得纯度为99.5%的白色AngⅡ醋酸盐纯品。

参考文献

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[3] 任付平， 朱立国， 陈五岭. 固相法合成多肽AN-M的工艺研究[J]. 现代生物医学进展， 2007， 7（1）： 25-27.

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[6] 张志刚， 何素婷， 何明华， 等. 二氯甲烷和DMF对DCCHOBt系统催化酯化及酰化反应的影响[J]. 生物化学杂志， 1997， 13（2）： 177-180.