靶向P2X3的microRNA系统性筛选

库尔班江·阿布力克木 许盛飞 曾瑾 袁晓奕

膀胱过度活动症(overactive bladder， OAB)是临床常见的排尿功能障碍性疾病，对患者的工作和生活均造成严重影响，随着年龄的增长其发病率逐渐提高[1]。对于OAB的治疗目前尚无法取得满意效果[2]。嘌呤受体P2X3是一种ATP门控的离子通道蛋白，近年来研究证实P2X3在膀胱充盈感觉和痛觉的产生和易化过程中发挥核心作用[3-4]。我们的前期研究发现女性原发性OAB患者其膀胱敏感性与膀胱内P2X3表达水平具有显著相关性[5]，另有研究显示OAB患者膀胱内某些可能与P2X3相关的microRNAs(miRNAs)出现异常表达[6]，因此推测靶向P2X3的miRNAs表达异常是致敏膀胱导致OAB的重要致病原因。本研究对靶向P2X3的miRNAs进行了系统筛选和鉴定，旨在寻找新的诊断OAB的分子标志物和潜在治疗靶点。

材料与方法

一、实验材料

人胚肾293TN细胞系，DMEM 培养液，10%胎牛血清，感受态大肠杆菌 TOP10，荧光素酶检测试剂盒，质粒提取试剂盒，P2X3 一抗。

二、实验方法

1.利用在线miRNA数据库/预测软件TargetScan、miRDB、miRanda、PicTar、RNA22、miRWalk、PITA在线查询P2X3 3′端非编码区(3′untranslated region， 3′UTR)序列的靶向miRNA。

2.双荧光素酶报告基因P2X3 3′UTR质粒的构建和提取：从基因文库中钩取P2X3序列全长，设计引物扩增P2X3 3′UTR全长，构建psiCHECK2-P2X3 3′UTR载体质粒。将构建的质粒分别转化到大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，扩增，提取质粒。

3.双荧光素酶报告基因载体与 miRNA mimics/阴性对照(NC)共转染 293TN细胞：将生物信息学方法预测的miRNA分别同psiCHECK2-P2X3 3′UTR双荧光素酶报告基因质粒共转染293TN细胞，并测定Firefly荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性，以Firefly 荧光素酶活性为内参，计算Renilla/Firefly比值(相对荧光素酶活性)。以转染的miR-NC为1校正各比值，以此判断预测的miRNA是否与P2X3 3′UTR序列结合。各转染miRNA的荧光素酶结果同miR-NC比较。

4.将筛选得到的miRNAs mimics转染293TN细胞，利用Western blot检测P2X3转录后水平的变化，进一步筛选能够靶向调控P2X3的miRNAs，选取Tubulin为内参。

5.突变体质粒的构建及鉴定：以已构建的 psiCHECK2-P2X3 3′UTR 质粒为基础，按照其与不同 miRNA 结合的种子序列，设计点突变的 mutant位点，构建突变体载体质粒。按前述实验步骤，将构建的突变体质粒分别转化到大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，扩增，提取质粒。再按前述实验步骤，将突变体载体质粒与相应的miRNA mimics/NC共转染293TN细胞，转染细胞培养 48 h后，检测荧光素酶活性，以最终确定特异性靶向结合P2X3 3′UTR的miRNAs。

三、统计学方法

所有数据以均数±标准误表示，应用 SPSS 21.0 软件进行统计学分析，样本均值间两两比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、生物信息学软件对靶向结合P2X3的miRNAs的预测分析

分析结果表明有多达21种miRNA可能与P2X3结合。见图1。

二、荧光素酶报告系统验证及转染293TN细胞后P2X3的表达

验证结果表明，有3种miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能显著下调报告基因的表达。在293TN细胞中过表达上述3种miRNAs后，P2X3蛋白表达显著下调，证实这3种miRNAs可能靶向调控P2X3。见图2。

图2 过表达3种miRNAs后293TN细胞中P2X3蛋白的表达

三、特异性靶向结合P2X3 3′UTR的miRNAs的进一步验证

构建相应的P2X3 3′UTR突变体的双荧光素酶报告载体，再次进行荧光素酶检测，最终确定特异性靶向结合P2X3 3′UTR的miRNAs共3种，为hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291。

讨 论

嘌呤受体P2X是一组ATP门控的跨膜离子通道，由3个同源或异源的P2X亚基聚合而成。迄今发现的7个P2X(P2X1～7)亚基同源性约35%～50%，由大约400～600个氨基酸残基组成，其C末端和N末端均位于细胞内，其余部分组成糖基化的胞外域，构成蛋白质的功能区。P2X3受体是由同源聚合体(P2X3)或异源聚合体(P2X2/3)组成的寡聚体，在正常生理条件下特异性地表达于外周感觉神经元、中间神经元和体内空腔脏器的上皮组织。研究显示敲除P2X3基因的大鼠对外周和膀胱刺激导致的痛觉反应及排尿反射明显减弱，表明P2X3在外周痛觉反射和膀胱容量反射的传入通路中扮演着极其重要的角色[7]。OAB动物模型的研究发现，膀胱内H+和表皮生长因子等细胞因子浓度的升高可增强P2X3途径的信号传递，导致感觉神经纤维激活，诱发膀胱逼尿肌过度活动；P2X3受体又可以信号内吞体的形式逆向转运至胞体，调节胞体中转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化水平，进一步提升神经纤维的兴奋性，同时致敏的神经纤维还可通过上调脊髓内突触前P2X3受体的表达水平来进一步放大上行性的伤害感受从而加重OAB症状[8]。由此可见，P2X3在膀胱充盈感觉和痛觉的产生、易化过程中发挥着核心作用。我们之前的研究同样发现膀胱敏感性升高是女性原发性OAB发病的重要致病因素，且与膀胱黏膜内P2X3的表达水平具有统计学相关性[5]，提示P2X3过表达引起的膀胱过敏可能是导致原发性OAB发生的重要致病原因。

研究发现，miRNA也可靶向调控P2X分子，如miR-150在肺泡细胞内靶向调控P2X7，miR-186和miR-150在上皮性肿瘤(包括宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、乳腺癌)中靶向调控P2X7[9-10]。P2X3能否被miRNA调控，目前还没有任何相关报道。有报道显示Dicer酶缺乏的转基因大鼠的膀胱被诱导致敏后，膀胱内P2X1和P2X3表达显著升高，同时有若干相关miRNAs表达异常[6]，提示miRNA极有可能对P2X3具有靶向调控作用。

目前系统研究靶向单个基因miRNAs的方法的相关报道不多，根据其核心实验方法的不同大致可分为两类：一种称为蛋白裂解芯片技术(lysate microarray， LMA)，主要是基于过表达miRNAs后目标蛋白水平的变化；另一种研究主要基于miRNA特异结合的靶基因3′UTR荧光素酶报告系统。以上两种方法各有优缺点，基于LMA的方法对生物信息学分析依赖程度较低，由于不同的生物信息学分析软件基于的算法和数据库差异较大，可能对最终的筛选结果造成影响，因此LMA的准确率更高，但是该方法对仪器和操作以及实验成本要求较高，对于普通实验室来说，难以开展；后者虽然对实验条件的要求不高，但是受生物信息学分析的影响较大，且稳定表达细胞系的筛选较为耗时，整个实验周期较长。我们在后者的基础上进行了改进和优化，首先将多种生物信息学预测软件的结果进行合并，尽量排除利用单一或少数软件分析所造成的误差和遗漏；其次用双荧光素酶报告系统替代单荧光素酶报告系统，利用内置的Firefly荧光素酶作为内参，消除了转染效率可能造成的差异，从而不需要构建稳定表达细胞系，使得实验周期大大缩短。我们利用该系统成功对泌尿系肿瘤中靶向OCT4基因的miRNAs进行了系统分析[11-12]。

本实验通过采用TargetScan等生物信息学软件，初步对人P2X3 3′UTR进行了综合分析，结果发现分别有21种潜在的miRNAs可能与人P2X3靶向结合，在此基础上我们构建了包含P2X3 3′UTR全长的双荧光素酶报告系统psiCHECK2-P2X3，将该载体质粒分别与上述21种miRNAs共转染293TN细胞，然后通过检测报告基因的表达及转录后水平的变化进行筛选，初步证实共有3种miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)能够靶向结合P2X3的3′UTR，并显著下调其表达，表明确实有miRNA参与了对P2X3的靶向调控。

由于目前无法获得可用的正常膀胱尿路上皮细胞系，而基于293TN细胞系的miRNA研究比较成熟，故本实验中选取了293TN细胞系作为研究对象而非膀胱尿路上皮细胞系，我们希望通过本研究对miRNA治疗OAB的可能性进行一些探索。而经293TN细胞系筛选出来的靶向调控P2X3的miRNAs能否在OAB的治疗中起作用，需要进一步通过动物实验进行验证。未来，我们将在OAB患者相关组织标本中对分析得到的miRNAs进行表达检测和统计学分析，并将筛选得到的P2X3相关miRNAs载体转染OAB大鼠模型，以验证靶向调控P2X3的miRNAs对OAB动物模型进行治疗的可行性和有效性。

综上所述，我们发现共有3种miRNAs(hsa-miR-491-5p、hsa-miR-1178和hsa-miR-1291)参与了对P2X3的靶向调控，为OAB的临床诊断和靶向治疗提供了新的策略和作用靶点。