植物三萜皂苷代谢中糖基转移酶进化研究

赵志新，张思瑾

（商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）

三萜皂苷是植物界中一类重要的次生代谢产物，具有多种生物活性，其可增强植物抗病、抗虫害的能力，还具有抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、降低胆固醇、保肝等作用[1]。三萜皂苷合成途径，其第一步是先通过甲羟戊酸等途径生成异戊二烯焦磷酸，再经过催化酶鲨烯环氧酶等的催化，生成2,3-氧化鲨烯环化酶，环化形成三萜类骨架，然后通过细胞色素p450、糖基转移酶、β-糖苷酶的修饰作用，最后形成糖苷化合物——三萜皂苷[2]。糖基转移酶（GT,Glycosyltransferase）作为三萜皂苷生物合成的最后一步，对其基因的克隆以研究植物抗病机理及药用植物次生代谢调控机制目前已深入到了分子水平[3]。糖基转移酶在植物的生长发育过程和次生代谢调节方面起着重要作用[4]，经过糖基化修饰的受体分子能改变其在细胞内溶解性、稳定性和区域定位等特性，还能调节信号传导、细胞周期、应答反应、蛋白表达调控和清除细胞[5]。一直以来，对于糖基转移酶的研究多是以拟南芥为材料，近年来虽然有植物糖基转移酶体外生物化学方面的研究，但在糖基转移酶结构域和功能关系方面的研究进展还相对缓慢[6]。本研究利用生物信息学分析工具，首先搜集GenBank中已公布的植物糖基转移酶序列，然后使用生物信息学工具对糖基转移酶序列的保守结构域以及亲缘进化关系进行分析，为以后研究糖基转移酶酶学特征及三萜皂苷代谢提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

首先查找有关植物GT相关文献，然后依据查找文献并GenBank搜索，获得已公布的16种植物GT序列（见表1）。

表1 获得的具有糖基转移酶的植物

1.2 方法

使用NCBI提供的在线分析工具CDD（Conserved Domain Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白质序列保守结构域；使用MEGA 6.0软件构建系统进化树，分析所搜集的植物中GT进化关系。

2 结果与分析

2.1 保守结构域的预测和分析

图1为CDD工具显示红景天保守结构域结果；同样，利用CDD工具对其余15条序列进行保守结构域预测分析，结果见表2。

图1 红景天GT保守结构域分析

从图1可以看出，红景天GT氨基酸序列有一个GTB糖基转移酶超家族，有三类不同的保守结构域，分别为活性位点结构域（active site）、底物结合保守结构域（substrate-binding pocket）和TDP结合位点结构域（TDP-binding site）。其他植物GT也都属于GTB超家族（Accession登录号：Cl10013），具有统计极显著性（E<8.95×10-49），主要参与催化糖类转移的生物学功能。

表2 糖苷转移酶序列保守结构域

2.2 构建糖基转移酶系统进化树

使用MEGA 6.0软件对16种植物的GT序列构建进化树，采用不同算法以比较所构建树的差异，进而分析其亲缘关系。

2.2.1 Maximum Likelihood Tree算法构建进化树

依据Maximum Likelihood Tree算法（图2），这16种植物的GT序列可以分为三大类，滇牡丹（芍药科）和蒺藜苜蓿（豆科）为一类；野葛（蝶形花科）、北柴胡（伞形科）、七彩红竹（禾本科）和蔷薇（蔷薇科）聚为一类；其余的植物中，花生（豆科）为一个亚类，剩余的红景天等聚为一个亚类。进化关系显示，七彩红竹（禾本科）和蔷薇（蔷薇科）、三七（五加科）和黑莓（蔷薇科）、桉树（桃金娘科）和白苏子（唇形科）、红景天（景天科）和毛白杨（杨柳科）它们两两之间糖基转移酶进化关系最近。

2.2.2 Neighbor-joining Tree算法构建进化树

使用Neighbor-joining Tree算法构建的进化树显示（图3），这16种植物的氨基酸序列明显地分为三大类，北柴胡（伞形科）、蔷薇（蔷薇科）、七彩红竹（禾本科）、红景天（景天科）、毛白杨（杨柳科）、野葛（蝶形花科）聚为一类；黑莓（蔷薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）、三七（五加科）、天山雪莲（菊科）、桉树（桃金娘科）、白苏子（唇形科）为一类；花生（豆科）、刺五加（五加科）、滇牡丹（芍药科）、石榴（石榴科）为一类。其中毛白杨（杨柳科）和野葛（蝶形花科）、蔷薇（蔷薇科）和北柴胡（伞形科）、滇牡丹（芍药科）和石榴（石榴科）、桉树（桃金娘科）和白苏子（唇形科）、三七（五加科）和天山雪莲（菊科）、黑莓（蔷薇科）和蒺藜苜蓿（豆科）它们两两之间糖基转移酶进化关系最近。

图2 Maximum Likelihood Tree算法

图3 Neighbor-joining Tree算法

2.2.3 Maximum Parsimony Tree算法构建进化树

由图4可以看出，16种植物分为三大类，及野葛（蝶形花科）为一类；蔷薇（蔷薇科）、七彩红竹（禾本科）、北柴胡（伞形科）、桉树（桃金娘科）、黑莓（蔷薇科）、蒺藜苜蓿（豆科）为一类；滇牡丹（芍药科）、石榴（石榴科）、刺五加（五加科）、花生（豆科）、白苏子（唇形科）、红景天（景天科）、毛白杨（杨柳科）、天山雪莲（菊科）、三七（五加科）为一类。蔷薇（蔷薇科）和七彩红竹（禾本科）、红景天（景天科）和毛白杨（杨柳科）、滇牡丹（芍药科）和石榴（石榴科）它们两两之间糖基转移酶进化关系最近。

综合比较三种不同算法所构建的进化树，可以明显看出三种算法所得结果差异较大，说明这16种植物的糖基转移酶序列总体变异不大，进化上比较保守，以至于不同算法的影响远大于物种本身的差异。同时也表明算法对进化树构建结果影响较大，要审慎选择不同的进化树构建算法。

图4 Maximum Parsimony Tree(s)算法

3 讨论与结论

糖基转移酶催化的糖基化反应是三萜皂苷生物合成的最后一步，使得单糖与三萜皂苷苷元由糖苷键相连。本文通过使用生物信息学方法，显示16种植物的保守结构域都属于GTB超家族，主要参与催化糖类转移的生物学功能，表明糖基转移酶的功能结构域具有高度的保守性。进化分析表明，16种植物GT基因大致被分为三类，滇牡丹（芍药科）和石榴（石榴科）、红景天（景天科）和毛白杨（杨柳科）、蔷薇（蔷薇科）和七彩红竹（禾本科）它们两两之间糖基转移酶进化关系最近，说明GT基因在进化上具有一定的保守性，这与野葛中的研究结果相类似[7]，同时研究显示药用植物中鲨烯环氧酶进化也比较保守[8]，这与本文研究相一致。同时许多基因组数据表明，糖基转移酶基因在进化上不是独立的，在糖基转移酶基因家族中，旁系同源基因更易被选择；代谢途径中存在基因共调节和蛋白相互作用；代谢途径中某些化合物相互排斥；糖基转移酶进化还依赖基因重复，主要是串联重复，而不是片段重复[9]。因为酶的功能表现最终是催化代谢反应，对于粮食或药用植物来说与有效成分的生成或积累相关，本研究显示糖基转移酶在保守结构域和进化中都显示较高的保守性，因此建议下一步研究与糖基转移酶表达相关的三萜皂苷产物是否也有类似的特性，以指导人们开发和利用相近的植物资源。本文对糖基转移酶的生物信息学分析，可为以后研究GT酶学特征及三萜皂苷代谢提供帮助。