桑黄多糖的体外抗氧化作用研究＊

崔诗遥，曾 鹏，郎明紫，解鸿青，陈亚洁，李聪慧，沈张飞，李有贵，时连根＊

（1.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江 杭州 310021）

桑黄（Phellinus baumii）俗称桑耳、桑寄生，是一种珍贵的药用真菌，因寄生于桑树而得名，有“森林黄金”之美称。桑黄在我国作为名贵中药材入药已有2000多年历史，远在战国时期的《神农本草经》中就有“桑黄久服轻身不老延年”的记载。桑黄味微苦，性寒，中医认为其利五脏、软坚、排毒、止血等，可用于治疗血淋、血崩、脱肛泻血、带下、经闭、脾虚泄泻等［1，2］。现代药理学研究证实，桑黄含有多糖类、黄酮类、萜类等多种活性成分，临床用于调节机体免疫、延缓衰老、抗肿瘤、保肝护肝、降血糖、抗炎症等［3，4］。但桑黄的药理作用机理没有被很好研究，这阻碍了桑黄药用水平提高与药用范围扩大。本文通过桑黄主要活性成分多糖的抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羟基自由基（·OH）和还原力试验，研究桑黄多糖的体外抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 供试桑黄及主要试剂和仪器

桑黄子实体由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供，经干燥粉碎后过80目筛，于4℃存储备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为Sigma公司产品；FeSO4、双氧水（H2O2）、水杨酸、无水乙醇、维生素C、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3等化学试剂均为分析纯，购自中国医药上海化学试剂公司；D101大孔树脂购自天津兴南允能高分子技术有限公司。

UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；CR22GⅢ高速冷冻离心机（日本日立公司）；YQ-1002C型超声波清洗仪（上海易净超声波仪器有限公司）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂产品）；QT-80FC自动部分收集器（上海琪特分析仪器厂）；free zone 6 plus冷冻干燥机（Labconco公司）。

1.2 桑黄多糖的提取与纯化

提取采用超声波辅助乙醇浸提法［5］。称取桑黄子实体粉末，按照1∶26料液比（质量体积比，g/mL）加入双重蒸馏水，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500 W功率53 KHz频率的超声波场作用30 min，然后于100℃水浴中回流提取3次，合计提取时间4.35 h，每次提取后进行抽滤处理，并将滤液于10000 rpm离心5 min，取上清液。合并3次上清液，用旋转蒸发仪浓缩，得到桑黄多糖粗提液。

纯化采用依次过DEAE离子交换柱、Sephacryl S400凝胶柱、Sephacryl S200凝胶柱的方法［6］。取桑黄多糖粗提液过0.45 mm滤膜，先上DEAE离子交换柱，用0.1 M NaCl液洗脱，再上Sephacryl S400凝胶柱，用蒸馏水洗脱，最后上Sephacryl S200凝胶柱，用蒸馏水洗脱，自动收集器收集多糖洗脱液，-50℃下真空干燥，得到纯一桑黄多糖，用于体外抗氧化试验。

1.3 抗DPPH自由基活性测定

参考Hsu等（2006）报道的方法［7］。取不同浓度桑黄多糖溶液（用蒸馏水配制）2 mL，加入等体积的0.04 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇配制），混匀后在室温下避光反应30 min，3000 r/min离心10 min，取上清液在517 nm下测定吸光度，试验重复三次，以维生素C为阳性对照，按下公式计算DPPH清除率：

DPPH清除率（%）=［A3-（A1-A2）］/A3×100%，式中A1为2 mL桑黄多糖+2 mL DPPH的吸光值；A2为2 mL桑黄多糖+2 mL95%乙醇的吸光值；A3为2 mL蒸馏水+2 mL DPPH的吸光值。

1.4 抗羟其自由基活性测定

参照Smirnoff等（1989）报道的方法［8］。取用蒸馏水配制的不同浓度桑黄多糖溶液1 mL，加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，混匀后加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混匀后静置10 min，加入6 mmol/L水杨酸1 mL，混匀后37℃水浴反应30 min，3000 rpm离心10 min，取上清液于510 nm处测量吸光值Ai，以蒸馏水替换桑黄多糖液作为阴性对照组，以蒸馏水替换水杨酸作为空白对照组，以维生素C为阳性对照组，试验重复三次，按下公式计算羟基自由基清除率：

羟基自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）］/A0×100%，式中Ai为桑黄多糖组吸光值；A0为阴性对照组吸光值；Aj为空白对照组吸光值。

1.5 还原能力测定

参考李慎新等（2008）［9］的方法。用蒸馏水配制不同浓度的桑黄多糖溶液，取桑黄多糖液0.75 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）0.75 mL和1%铁氰化钾溶液0.75 mL，混匀后于50℃的水浴锅中反应20 min，再加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混匀后于3000 rpm离心10 min，取上清液1.5 mL，依次加入蒸馏水1.5 mL和0.1%FeCl3溶液0.1 mL，混匀，于700 nm下测定吸光值，吸光值越高则代表该化合物还原能力越强，试验重复三次。

1.6 数据统计分析

采用Excel和SPSS v20.0软件对试验数据进行统计分析，处理间差异采用LSD（Least Significant Difference）法比较，显著性水平P＜0.05，极显著水平P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 桑黄多糖对DPPH自由基的清除作用

测定桑黄多糖对DPPH自由基的清除作用，结果如表1所示。表1显示，桑黄多糖对DPPH自由基的清除率随着多糖浓度的增大而逐渐升高，表现较好的量效关系（相关系数R2=0.9955）；阳性对照维生素C对DPPH自由基的清除率高于桑黄多糖，表现出很强的清除作用。结果表明，桑黄多糖对DPPH自由基具有较强的清除作用。

表1 桑黄多糖抗DPPH自由基的活性Table 1 Anti-DPPH Function of PBPP

2.2 桑黄多糖对羟基自由基的清除作用

检测桑黄多糖对羟基自由基（·OH）的清除作用，结果桑黄多糖对羟基自由基的清除率随着多糖浓度的增大而升高，浓度与清除率间表现出良好的量效关系（相关系数R2=0.9770）；桑黄多糖对羟基自由基的清除率低于阳性对照维生素C（表2）。结果表明，桑黄黄酮对羟基自由基表现出较好的清除作用。

表2 桑黄多糖的抗羟自由基活性Table 2 Anti-hydroxyl Radical Function of Pbpp

2.3 桑黄多糖的还原能力

从表3可知，桑黄多糖的总还原力随着多糖浓度的增大而逐渐升高，并且表现出较好的线性关系（相关系数R2=0.9798）；桑黄多糖的还原力在低浓度（0.05 mg/mL）时基本与阳性对照维生素C的相近，随着浓度的升高，其还原力低于维生素C的幅度逐渐拉大。结果表明，桑黄多糖具有较强的还原能力。

表3 桑黄多糖的还原能力Table 3 Reducion Ability of Pbpp

3 讨论

多糖是除蛋白质和核酸以外的另一类重要生物大分子，广泛存在于植物、动物和微生物中，具有免疫调节、抗病毒、降血糖、抗炎、抗癌、抗氧化防衰老等广泛的药理作用，而且毒副作用极小，所以成为当今医药研究与应用的热点［10］。多糖种类繁多，不同有机体中存在不同种类与结构的多糖，即表现出不同的药理作用。本试验从总还原力、DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率这三个方面，检测了桑黄多糖的抗氧化作用，发现桑黄多糖具有良好的体外抗氧化性能，研究结果丰富了桑黄的基础药理学，并为桑黄多糖的产业化开发提供了理论依据。

DPPH是一种非常稳定的自由基，在515 nm处有特征性吸收，当孤对电子被中和后，DPPH的深紫色变浅或消失，所以常用于物质抗氧化活性的体外检测［11］。羟基自由基（·OH）是活性最强的一种自由基，能诱导膜系统的氧化损伤，从而危害生物体，诱发肿瘤、糖尿病、高血压等疾病，促进机体衰老［12］。还原力是反映一种物质抗氧化能力的一个很重要的指标，它能够反映此物质的供电子能力，进而反映出此物质的抗氧化活性［13，14］。本研究发现，桑黄多糖具有较强的还原力以及对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力，并且其还原力和自由基清除能力与其浓度呈量效关系，显示出良好的体外抗氧化作用。尽管桑黄多糖抗氧化活性弱于阳性对照维生素C，但在一定浓度范围内能够抑制自由基引起的氧化损伤，这对于离体大面积筛选抗氧化药物有一定的价值。体外抗氧化作用只反映出抗氧化性能的一个方面，所以要全面了解桑黄多糖的抗氧化性能，还需要结合体内外动物模型以及更多技术指标来进行全面完整的评价，此方面的工作有待深入研究。