甲状腺癌免疫细胞浸润模式及预后的相关性分析*

詹雪冰，董芳嫒，卢林明，孙恩涛，陶香香，陈 冰

(1.皖南医学院病理教研室，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院检验学院)

甲状腺癌(thyroid carcinoma)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，全球甲状腺癌56.7万例，发病率居世界第九位[1]。甲状腺癌中最常见的2种病理类型为甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌,可占到总发病人数的90 %[2]。未分化甲状腺癌往往具有高侵袭性、高病死率的特点，并且预后差[3]，这是治疗上的一个挑战。

由于免疫学和肿瘤学发展的不断深入以及交叉渗透,肿瘤免疫学渐渐成为肿瘤治疗的新热点,为肿瘤治疗带来新的希望[4]。关于恶性肿瘤预后与宿主全身免疫反应的相关性已经被大量研究证实, 治疗前的免疫相关指标往往能反映恶性肿瘤患者的预后[5]。相对于传统的治疗，肿瘤免疫治疗具有免疫记忆和无副作用等优点，因此要对癌症免疫有更深入的研究。本文利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)中甲状腺癌的表达谱数据, 并利用CIBERSORT计算其免疫细胞组成, 进一步分析其与甲状腺癌预后的相关性。

1 材料与方法

1.1数据来源 从公共数据库TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中下载基因转录本数据共570例, 包含甲状腺癌组织512例、正常甲状腺组织58例(到2019年7月为止)。下载的表达数据类型为HTSeq-FPKM。下载的甲状腺癌样本相关临床数据包含性别、生存时间、生存状态、临床分期、肿瘤分级、TNM分期。

1.2利用Cibersort计算组织中免疫细胞构成 提取甲状腺癌组织及正常组织转录本的mRNA表达谱数据, 使用R语言limma包对数据进行校正。肿瘤浸润免疫细胞的计算采用CIBERSORT算法，CIBERSORT是一种用于量化22种浸润的免疫细胞组成的分析工具。这22个免疫细胞包括M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、M0巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、活化的CD4+记忆性T细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞、幼稚CD4+T细胞、未活化的自然杀伤细胞、活化的自然杀伤细胞、未活化的肥大细胞、活化的肥大细胞、记忆性B细胞、静息态树突状细胞、活化的树突状细胞、幼稚B细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞。为提高精度，对每个样本以CIBERSORTP值<0.05为标准筛选，筛选出有意义的样本数据(甲状腺癌样本169，正常样本19)。选择符合过滤条件的TCGA数据集中肿瘤浸润免疫细胞进行相关分析并结合临床信息样本进行后续临床分析。将过滤后的免疫细胞表达矩阵与TCGA的临床信息矩阵融合，并对过滤的免疫细胞的生存分析以及免疫细胞与肿瘤分期的相关性进行评价。

1.3统计分析 所有分析均使用R软件进行。且分析采用CIBERSORT经过筛选后的病例。用barplot R包，pheatmap R包，vioplot R包分别进行每种免疫细胞占比柱状图、免疫细胞表达热图以及小提琴图的绘制。用corrplot R包检测不同免疫细胞间的相关性。生存R包用于Kaplan-Meier曲线分析。采用perl分析过滤后的免疫细胞与TNM分期的相关性。

2 结果

2.1甲状腺癌样本临床信息 从TCGA数据库中下载基因转录本数据及相关临床数据。TCGA中共登记509例确诊为甲状腺癌的患者，包括患者年龄、性别、肿瘤分期等详细临床特征。见表1。

2.2甲状腺癌中浸润免疫细胞情况 所有样本中，有169例肿瘤样本和19例正常样本符合CIBERSORT标准，P< 0.05。在甲状腺癌和正常组织中未发现CD4幼稚T细胞的明显比例。因此分析其他21种浸润免疫细胞的表达特征矩阵并绘制每种免疫细胞占比的柱状图、甲状腺癌及正常组织中免疫细胞的热图、甲状腺癌及正常组织中免疫细胞成分小提琴图以及甲状腺癌组织样本中每种免疫细胞水平相关图。见图1-4。

表1 TCGA中甲状腺癌的临床特点

注：NA表示未知

图1 所有样本中21种免疫细胞占比的柱状图

图2 所有样本中21种免疫细胞含量热图

由图1及图2可见,在甲状腺癌组织中浸润水平最高的五种免疫细胞类型分别是:M0巨噬细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、浆细胞、M2巨噬细胞、CD8+T细胞。由图3可见在正常组织中，CD8+T细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、浆细胞、幼稚B细胞和记忆B细胞的浸润率最高。与正常组织相比，M0巨噬细胞、M2巨噬细胞以及静息态树突状细胞以及未活化的肥大细胞的比例普遍较高(P<0.001)。与肿瘤组织相比，正常组织中幼稚B细胞、CD8+T细胞、滤泡辅助性T细胞、γδT细胞的比例普遍较高(均P< 0.01)。由图4可见在甲状腺癌组织中, 构成比相关系数较大的免疫细胞包括:M0巨噬细胞与CD8+T细胞(-0.59), M0巨噬细胞与浆细胞(-0.56), CD8+T细胞与浆细胞(0.49)，CD8+T细胞与M1巨噬细胞(0.46)。

2.3甲状腺癌免疫细胞浸润与预后的关系 利用R语言中的survival包计算免疫细胞浸润程度与生存的相关性, 具有统计学意义(P<0.05)的细胞包括M0巨噬细胞和CD8+T细胞, 其中M0巨噬细胞构成比例高者生存期短, CD8+T细胞构成比高者生存期长, 生存曲线。见图5。

图4 甲状腺癌组织样本中每种免疫细胞占比相关图

2.4免疫细胞和临床相关性的分析 评估免疫细胞与原发肿瘤(T)分期的相关性。T1-2期肿瘤中活化的树突状细胞, CD4+记忆性T细胞, 静息态树突状细胞, 未活化的肥大细胞、单核细胞明显低于T3-4期肿瘤(P<0.05)。T1-2期肿瘤中γδT细胞和浆细胞明显高于T3-4期肿瘤(P< 0.05)。见图6。

图5 免疫细胞构成水平的生存曲线

图6 免疫细胞与原发肿瘤(T)分期的相关性

3 讨论

最新的观点认为,巨噬细胞在免疫微环境中主要发挥肿瘤促进的功能, 与多种肿瘤的侵袭性行为相关, 与肿瘤病人的不良预后相关[6]。可依据功能将巨噬细胞分为M1和替代型M2巨噬细胞[7]。把握和控制M1、M2型巨噬细胞之间的平衡是探索疾病治疗新方法的切入点[8]。本研究发现M0，M2巨噬细胞在甲状腺癌患者中表现为高充盈，M0巨噬细胞构成比例高者生存期短。可能提示在肿瘤进展期间, 巨噬细胞将被逐渐募集到肿瘤组织中, 改变肿瘤微环境以调节肿瘤进展。

本研究结果显示, 高水平的CD8+T细胞与甲状腺癌患者较好的生存率相关。在既往对肿瘤免疫细胞的研究发现，肿瘤相关中性粒细胞的消耗导致活化的CD8+T细胞增加并减缓肿瘤的生长[9-10]。本研究表明，CD8+T细胞可以提高甲状腺癌患者生存率。

单核细胞可以间接促进细胞外基质降解和肿瘤血管新生, 继而促进肿瘤的进展和转移[11]。本研究表明, 高比例的单核细胞与胃癌患者较差的预后相关, 进一步证明单核细胞在促进肿瘤发展中的作用。

在肿瘤环境中, 肥大细胞刺激血管生成从而导致肿瘤的生长和发展[12]。本研究显示未活化的肥大细胞比例在甲状腺癌患者中较高，且未活化的肥大细胞含量在甲状腺癌患者T3和T4期的中也表现为高充盈状态，这可能提示肥大细胞在甲状腺肿瘤的发生发展中起促进作用。

本研究表明，静息态树突状细胞在甲状腺癌中富集分数增加，并且较T1和T2期，在T3和T4期静息态树突状细胞和活化树突状细胞比例都增加。这与之前针对乳头状甲状腺癌的研究一致[13]，在正常的甲状腺组织中很少发现树突状细胞，但在乳头状甲状腺癌中不成熟表型的树突状细胞增多，从而抑制免疫反应。

综上所述，CIBERSORT在分析整个组织的组织表达数据中非常重要，它提供关于甲状腺癌免疫细胞的明确信息。确定浸润性免疫细胞与甲状腺癌进展之间的关系, 发现浸润性免疫细胞在甲状腺癌癌中的预测作用，并且与临床结果密切相关。甲状腺癌免疫细胞与正常组织免疫细胞的差异可能成为免疫治疗鉴定的新途径，为甲状腺癌患者的治疗策略提供参考。