电针对局灶性脑缺血大鼠基底外侧杏仁核前部Gas7和NGF表达的影响*

方 雷,罗潇潇,陈光悦,孟 兴,丁 见,缪化春

(1.皖南医学院临床医学院2015级,安徽 芜湖 241002;2.皖南医学院人体解剖学教研室)

在我国脑缺血疾病(ischemic cerebral disease)发病率目前呈不断上升的趋势，脑缺血发生后由于血液供给急剧减少，细胞能量供给匮乏，导致大多数细胞肿胀、坏死[1]，危害较大且无有效的治疗方法，研究其中的机制具有重大意义。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)作为神经营养因子的典型代表之一可促进神经元生长及分化，具有维持神经元的存活、发育及修复受损神经元作用[2]。另外，生长休止特定蛋白7(growth arrest-specific protein 7,Gas7)介导NGF诱导神经细胞分化的过程[3]。关于Gas7在受损神经元的表达中所起的作用，目前尚不明确。

电针治疗可以促进脑部功能的改善，控制和调整信息的传出[2]，有研究指出针灸对治疗脑缺血具有独特的优势，其对脑缺血后神经、血管再生具有显著的临床效应[4]，但机制尚不完全清楚，基础性研究仍在不断深入与拓展中。杏仁核属于边缘系统，对应激反应很敏感，受损后可致恐惧学习、记忆缺失和情感记忆障碍[5]。目前尚未见关于电针对局灶性脑缺血大鼠基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)前部Gas7和NGF表达影响的报道。实验采用尼氏染色、免疫组织化学染色法检测大鼠患侧BLA前部Gas7和NGF的表达。目的在于探讨电针对于局灶性脑缺血大鼠的影响及与Gas7和NGF表达及修复再生的关系，为临床提供脑缺血治疗的相关基础性资料。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 成年雄性SD大鼠24只，体重(220.0±20.0)g，许可证号：SCXK(苏)2017-0001。将大鼠适应性饲养14 d后随机分为正常对照组、假手术组、模型组和电针组，每组6只。实验过程中对动物的操作和处理严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》的有关规定。

1.2主要试剂与仪器 戊巴比妥钠(美国Sigma公司)，多聚赖氨酸Poly-L-ly-sine(武汉博士德生物工程有限公司)，30 %过氧化氢稀释液(天津市百世化工有限公司)，PBS缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)，Gas 7(美国Sigma公司)和NGF抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根生化科技有限公司)，华佗牌电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)，轮转式石蜡切片机(型号：RM2235，德国Leica公司)，BX51显微镜、Express C图像分析系统(日本，OLYMPUS)。

1.3造模方法 参照文献[6]用线栓大鼠右侧大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法复制局灶性脑缺血动物模型。大鼠按照30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后取仰卧位将大鼠绑在手术台上，备好结扎动脉的线再剪去颈前的鼠毛，用碘伏消毒，沿颈部正中切开皮肤，继续钝性分离皮下组织，分离到气管前肌后沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈总动脉后可向上拉钩、分离动脉鞘，分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，夹闭颈内动脉，用显微剪将颈总动脉剪一小口、插入鱼线(1.8±0.5)cm、结扎颈总动脉、缝合。等大鼠清醒后，若出现右侧肢体瘫痪、站立不稳、提尾时向一侧转圈，即造模成功。

1.4治疗方法 造模成功后，各组大鼠均于恒温(22 ℃～25 ℃)条件下饲养。正常对照组、假手术组和模型组大鼠给予常规饲养；对电针组大鼠按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉成功后将大鼠侧卧位放置，对“足三里”穴和“百会”穴，用频率2 HZ、强度3 V、波宽1 ms的连续波连续电针治疗14 d，1次/d，30 min/次。

1.5组织取材 电针结束后按30 mg/kg对各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，分别备好已吸入100 mL生理盐水和300 mL已过滤的多聚甲醛固定液的吊瓶，麻醉后从剑突下剪开胸腔暴露膈肌，剪开膈肌与两侧肋，暴露心脏，剪开左心耳，从心尖处插入装有100 mL生理盐水的吊瓶针至主动脉弓，先注入100 mL生理盐水，再注入300 mL已过滤的多聚甲醛固定液(前100 mL快速注入，剩余200 mL缓慢注入)固定后取脑，将取出的脑组织放入4 ℃,4.0 %多聚甲醛固定液浸泡24 h，再经过脱水、石蜡包埋后将组织块放入4 ℃冰箱，连续切片收集后放入4 ℃冰箱保存以便后续使用。

1.6尼氏染色 切片5 μm常规脱蜡(二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ15 min、梯度酒精脱水100.0 %Ⅰ、100.0 %Ⅱ、95.0 %、85.0 %、70.0 %各5 min)、蒸馏水洗3次(各5 min)，置于37 ℃温箱用1.0 %甲胺蓝染色6 min、蒸馏水洗净、置于95.0 %酒精脱水5 s、中性树胶封片。

1.7免疫组织化学方法及实验指标的观察及检测 切片脱蜡后放入枸橼酸缓冲液中进行抗原微波热修复，滴加3.0 %过氧化氢室温放置10 min(避光)灭活内源性酶，滴加5.0 %BSA封闭液放入37 ℃温箱60 min，滴加一抗Gas7(1∶100)、NGF(1∶150)放入4 ℃冰箱18 h，取出放入37 ℃温箱1 h后滴加二抗生物素化兔抗山羊IgG(1∶100)、羊抗兔IgG(1∶100)，放入37 ℃温箱2 h，滴加SABC放入温箱1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，流水冲洗，自然晾干后放入100.0 %二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5 min后中性树胶封片，各步骤之间均用0.02 mol/L的PBS(pH7.2～7.4)冲洗3次。结合显微镜、大鼠脑立体定位图谱、图像分析系统对右侧BLA前部的Gas7和NGF的免疫阳性细胞进行拍照、计数，并统计平均灰度值。

2 结果

2.1神经元细胞形态学分析 光镜下可见经尼氏染色的正常对照组和假手术组神经元形态完整、排列规则、胞核清晰，模型组和电针组神经元细胞层次明显紊乱、数量增多、部分胞质萎缩。其中电针组较模型组神经元细胞数量增加，萎缩神经元明显减少。见图1。

图1 各组大鼠右侧BLA前部阳性神经元的表达(尼氏染色法，×400)

2.2Gas7的表达 在光学显微镜下可见切片上大鼠右侧BLA前部有胞膜和胞浆呈棕黄色的Gas7阳性神经元。假手术组Gas7阳性神经元数量和平均灰度值与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；模型组Gas7阳性神经元数量与正常对照组相比增加(P<0.05)，而染色明显加深、平均灰度值降低(P<0.05)；电针组Gas7阳性神经元数量与模型组相比增加(P<0.05)，而染色明显加深、平均灰度值降低(P<0.05)。见图2、表1。

图2 各组大鼠右侧BLA前部Gas7的表达(免疫组织化学染色法，×400)

2.3NGF的表达 在光学显微镜下可见切片上大鼠右侧BLA前部有胞膜和胞浆呈棕黄色的NGF阳性神经元。假手术组NGF阳性神经元数量和平均灰度值与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；模型组NGF阳性神经元数量与正常对照组相比明显增加(P<0.05)，而染色明显加深、平均灰度值降低(P<0.05)；电针组NGF阳性神经元数量与模型组相比明显增加(P<0.05)，而染色明显加深，平均灰度值降低(P<0.05)。见图3、表1。

图3 各组大鼠右侧BLA前部NGF的表达(免疫组织化学染色法，×400)

表1 各组大鼠右侧BLA前部Gas7和NGF免疫阳性细胞数及灰度值

注：a表示与正常对照组比较P<0.05；b表示与模型组比较P<0.05

3 讨论

在我国脑血管病已成为致死、致残率较高的疾病之一，其中缺血性脑血管病约占80.0 %[7]，其危害性更大。现存缺血性中风患者中，有一半以上的患者初次发病在50岁以前，即中青年人群，且有年轻化的趋势[8]。目前脑缺血尚无有效的治疗方法，且愈后较差，严重地影响着人们的工作能力及生活质量，给个人、家庭和社会带来极大的精神及经济负担，因此尽快找到脑缺血的最佳治疗方案成为当务之急。目前对于脑缺血的防治手段主要包括药物治疗和针刺治疗，目前西药治疗已取得一定效果，但不良反应较多，且价格较为昂贵，加重了患者的经济负担，难以进行长期正规治疗，而针刺治疗经济实惠且对脑缺血后神经元的再生修复以及突触的可塑性调节取得了明显效果[9]。本研究中的尼氏染色结果显示正常对照组和假手术组神经元数量较少，模型组神经元细胞与正常对照组和假手术组相比数量增多、部分胞质萎缩。据此推断本实验造模成功，可用于电针治疗。

Gas家族的基因均与细胞的生长与分化有密切关系，Gas7是其中的一员，首次发现于成纤维细胞，较多的表达在神经系统，有研究表明Gas7与神经细胞的修复、传导有关，对外周神经元的生长发育具有促进作用[10]。Gas7对受损神经元有保护作用，在慢性复合应激模型中可诱导神经干细胞向神经细胞分化等，从多方面参与了神经系统的损伤修复[11]。本实验结果显示模型组大鼠右侧BLA前部的Gas7阳性神经元数量明显多于正常对照组和假手术组，平均灰度值相较于正常对照组和假手术组降低，表明Gas7在缺血后的BLA前部表达增强，这种结果说明Gas7可能对于神经元的保护及修复具有一定的作用，但机制尚不清楚，有待研究。

哺乳动物体内有四种神经生长因子，分别是：NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5[12]，神经生长因子NGF是神经生长因子家族中的一员，有研究指出在神经元的损伤修复期，NGF能促进成神经纤维的定向生长，诱导轴突树突的发育[12]，且神经生长因子NGF是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。有研究显示大鼠脑缺血后脑组织中NGF含量可自发的上调，与本研究发现模型组大鼠右侧BLA前部的NGF阳性神经元表达较强相一致，推测可能是缺血诱发了组织保护修复机制的启动，但这种含量的增加具有一定的限度，其维持的时间较短，上调NGF的量较少故不足以对脑缺血形成稳定的、有效的、较长时间的保护作用。所以需要寻找安全、合理、有效、稳定的干预手段来上调NGF的表达，从而实现对受损神经元的保护。

针刺治疗“百会”、“足三里”穴可以益气行血，通经活络，短暂高频刺激下突触传递效率和强度增加数倍并且能保持这种状态数小时甚至几天[13]，有利于脑部气血、肢体功能的恢复。本实验通过频率2 HZ、强度3 V的电针对MCAO模型大鼠进行为期14 d的治疗后，结果显示尼氏染色检测电针组萎缩神经元较模型组明显减少，神经元数量增加、层次清晰。免疫组织化学染色法检测电针组大鼠右侧BLA前部的Gas7阳性神经元和NGF阳性神经元数量多于模型组，且平均灰度值低于模型组，提示电针治疗对于右侧BLA前部Gas7神经元和NGF神经元的表达可能具有促进作用，Gas7和NGF在电针治疗作用下表达进一步提升可能具有脑保护作用，推测电针对于脑缺血大鼠可能具有治疗作用。本实验对临床研究局灶性脑缺血的保护及修复机制提供了数据参考，丰富了神经元再生的研究资料。