茶多酚对红细胞膜氧化损伤保护作用的研究*

李欣洋，郭 磊，刘亭丽，王 雷，张春霞，刘晶晶，魏春华，李晓晶，李嘉欣,

(1.内蒙古科技大学包头医学院2015级临床学院，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院生物化学与分子生物学教研室)

茶多酚是从茶叶中提取的一种多酚类化合物，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等[1]。茶多酚主要为黄烷醇(儿茶素)类，儿茶素占60 %～80 %。类物质茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为辐射克星。已有研究表明，茶多酚具有抗氧化作用，主要体现在清除自由基、抗衰老、抗辐射以及防癌等方面[2]。我们向红细胞悬液中添加抗氧化剂茶多酚，观察其对红细胞膜的影响，明确茶多酚是否可通过抗氧化作用保护红细胞。

1 对象与方法

1.1对象及仪器 血液标本经包头医学院伦理委员会审核批准，从包头医学院第二附属医院检验科取60份健康成人新鲜肝素抗凝静脉血，4 ℃保存。主要仪器与试剂有高速离心机(德国Eppendorf公司)，全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)，水平电泳槽(DYY-Ⅲ型)、稳压稳流电源(DYY-2C)，17 cm×17 cm玻璃板等。茶多酚(西安沛森生物科技有限公司)。EDTA、乙醇、硼酸、四氯化碳、Tris、淀粉、氨基黑、冰醋酸等均为国产分析纯；琼脂糖，西班牙进口分装。

1.2方法

1.2.1红细胞悬液的制备 将采集后的血液滤白、离心去血浆，分别用终浓度为0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL的TP-NS溶液与红细胞作用3 h后进行HRT，离心后的上清液进行溶血率测定。以未加TP-NS处理的0 mg/mL组为对照组，参照溶血率值以生理盐水和溶血液的50倍稀释液，在540 nm处吸光值为参照。溶血率=(吸光值-生理盐水吸光值)/(溶血液吸光值-生理盐水吸光值)×100 %。

1.2.2血红蛋白释放实验 依据实验要求制备淀粉琼脂糖凝胶，分别取反应液10 μL点到1 cm×0.2 mm滤纸条上，并插入到凝胶中，120 V电泳1 h后，断电5 min，再次通电电泳1 h后将胶板置于氨基黑10B中染色，次日用50 g/L冰醋酸溶液反复漂洗至背景无色，晾干后观察结果并拍照。利用Bandscan 5.0软件做区带灰度扫描。

1.2.3红细胞溶血率检测 取各组上清液100 μL/组，分别用生理盐水稀释6倍后，测定540 nm处的吸光度，测平行标本4个/组。

1.2.4统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件处理，采用One way Anova比较组间均数差别，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同浓度TP作用后红细胞Hb再释放比较 电泳结果表明，与未加茶多酚的对照组(0 mg/mL)比较，各浓度茶多酚均可以使Hb再释放减少，随着TP浓度增高(0.3 mg/mL)，红细胞Hb再释放量逐渐减少，浓度达到0.4 mg/mL时，再释放量增多，超过0.5 mg/mL后，再释放量又呈降低趋势(图1、图2)。

图1 不同浓度TP作用后凝胶电泳图谱和释放Hb的半定量的分析

2.2红细胞溶血率 不同浓度TP作用红细胞后的溶血率变化用等体积0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL不同浓度TP作用红细胞3 h后抽取上清液，结果显示红细胞溶血率变化不明显(P>0.05)，见图2。

图2 不同浓度TP处理红细胞对红细胞膜的溶血率

3 讨论

自由基在正常组织细胞的生存和代谢中不断地产生，正常情况下，其产生和清除可维持低水平的、有利无害的平衡。在某些情况下，这一平衡被打破，自由基浓度超过生理限度，过量的自由基就介导脂质过氧化作用造成机体各种损伤[3]。由于红细胞本身特别易受氧化损伤，其抗氧化能力强弱及被氧化程度与整个机体的抗氧化能力及机体多种疾病的发生密切相关。过氧化损伤可以导致红细胞酶活性降低、形态改变、携氧能力降低等不良反应，进而影响人体健康。前期的体外实验研究表明，茶多酚对离体红细胞的氧自由基损伤有较强的抑制作用[4]。茶多酚可保护黄嘌呤氧化酶、过氧化氢和紫外线照射等自由基产生体系诱导的红细胞膜脂质过氧化损伤，维持红细胞膜的结构完整性和正常功能[5]。

红细胞血红蛋白释放试验是将未裂解的完整红细胞悬液借助滤纸片加在淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳，电泳过程中经过通电-断电-再通电，就会出现Hb再释放条带[6]。本实验将HRT技术应用于茶多酚对红细胞的保护作用，研究结果表明，添加茶多酚可以使红细胞Hb再释放含量降低，且溶血率测定结果表明采用不同浓度范围的茶多酚对红细胞没有明显的破坏作用。该结果提示茶多酚能通过抗氧化作用保护红细胞。但茶多酚是否可以保护红细胞的形态、是否影响红细胞能量代谢和携氧能力，还需要进一步研究。