血清微RNA-21和磷酸脂酶-张力蛋白同源物在糖尿病心肌病患者中的表达及其临床意义

唐 艳 邓苏辛

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一类发生于糖尿病患者，以心力衰竭为主要临床表现，不能用高血压性心脏病、冠状动脉性心脏病(简称冠心病)，以及其他心脏病变来解释的心肌疾病。其发病机制复杂，目前未被完全了解。微RNA(miRNA)为一种小分子非编码RNA，通过与靶基因mRNA分子的3’-非编码区(3’-UTR)配对并与之结合，从而降解靶mRNA，抑制翻译，参与多种心血管疾病的病理生理过程[1]。近来研究表明，miRNA与DCM有一定的相关性，未来可能成为DCM的治疗新靶向。在众多miRNA中， miRNA-21(miR-21)在心肌细胞中高表达，参与许多心血管疾病如缺血性心肌病、心肌肥厚、心力衰竭等病理生理过程。miRNA未来可能成为DCM的治疗新靶点[2]。miR-21介导的心血管效应的靶基因有4个，分别是程序性细胞死亡因子4(PDCD4)、磷酸脂酶-张力蛋白同源物(PTEN)、sprouty1(SPRY1)和sprouty2(SPRY2)。其中PTEN是迄今发现的唯一具有蛋白脂酶和磷酸酶双特异活性的靶基因,通过复杂的信号转导通路，如：磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、黏着斑激酶(FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p53/双微体2(MDM2)、NF-κB在增生性血管疾病、缺血性心肌病、心脏肥大、心力衰竭和心脏纤维化等心血管疾病中发挥重要作用[3]。本研究小组在前期细胞和动物实验中发现，miR-21能通过负性调控PTEN抑制心肌细胞凋亡和心力衰竭的发生发展，PTEN/Akt/叉头框蛋白(FOX)O3a信号转导通路参与其中[4-5]。本研究旨在检测DCM患者血清miR-21和PTEN的表达水平，结合超声心动图相关指标和N末端B型钠肽前体(NT-proBNP)行相关性分析，探讨血清miR-21和PTEN在DCM患者中的临床意义，为DCM的诊断和治疗开辟新的方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择 2017年5—12月在南华大学附属第一医院心血管内科住院的DCM患者40例为DCM组，其中男30例、女10例；平均年龄 (62.5±2.1)岁；另选择同期同一医院行体格检查的健康者20例为正常组，其中男10例、女10例；平均年龄(61.9±1.8)岁。DCM的诊断参照WHO/国际心脏病学会联合会(ISFC)的诊断标准。本研究通过南华大学附属第一医院伦理委员会审核批准。两组受检者均为自愿参加并签署知情同意书。排除标准：继发性糖尿病、恶性肿瘤、外伤、感染、贫血和自身免疫性疾病、长期服用激素类药物的患者。

1.2 方法

1.2.1 观察指标 采集两组受检者清晨空腹肘静脉血3 mL，检测血清NT-proBNP水平；同时另留取肘静脉血5 mL，置于真空无抗凝管中,样本置于离心机中，1 h内4 ℃,3 000 r/min离心15 min(离心半径为10 cm)，将上层液转移至1.5 mL eppendorf管中12 000 r/min离心5 min(离心半径5 cm)， 再将上层血清转移至新1.5 mL eppendorf管中，标记并将其分装，保存于-80 ℃冰箱，样本处理于2 h内完成。采用实时荧光定量聚合酶链反应 (qRT-PCR)检测血清miR-21和PTEN mRNA的表达水平，ELISA法检测各组血清PTEN蛋白质的表达水平。由本院超声科医师对两组受检者进行超声心动图检查，测量左心室舒张末内径(LVEDd)、左心室射血分数 (LVEF)、舒张早期/舒张末期心室充盈速率(E/A)。

1.2.2 主要仪器和试剂 全自动生化仪为瑞士罗氏公司产品，定量荧光PCR仪为美国ABI生物公司产品。QIAzol裂解液、miRNeasy 血清(血浆)提取试剂盒购自德国Qiagen公司，PrimeScrip®miRNA cDNA一步合成试剂盒、SYBR®Green荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，1 kp DNA ladder标志物购自美国Fermentas公司，miR-21、PTEN mRNA、 β-actin和U6引物购自上海捷瑞生物有限公司，ELISA试剂盒购自上海BG公司。

1.2.3 血清miR-21和PTEN mRNA相对表达量 ①总RNA提取：取200 mL血清与5倍体积的QIAzol裂解液混匀，静置15 min后提取总RNA，按miRNeasy 血清(血浆)提取试剂盒操作说明进行，用氯仿去蛋白质处理，乙醇沉淀RNA成分，加入12 mL DEPC水溶解RNA。②cDNA合成：按照PrimeScrip®miRNA cDNA一步合成试剂盒说明书将所提取的RNA合成cDNA，反应条件为37 ℃ 60 min聚合腺苷酸(PolyA)加尾和反转录反应，85 ℃ 5 s酶失活，合成20 μL反转录液，将其稀释5倍用于PCR分析。③PCR：参照日本TaKaRa公司SYBR®Green荧光定量PCR试剂盒说明方法制备 20 μL反应体系，于 ABI 7500荧光定量PCR仪中扩增，miR-21正向引物为5’-CCT GCC TGA GCA CCT CGT GC-3’,反向引物为5’-GAC TGT GAC GAC TAC CCC AA-3’，产物75 bp。预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45个循环。内参基因U6正向引物为5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物: 5’ -AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，产物109 bp。预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 20 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40～45个循环。PTEN mRNA正向引物为 5’-TCA TGG TGC TGG TGG CTC TG-3’，反向引物为5’ -TGT GCT GGG GTT GGC TAT TT-3’，产物146 bp。预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40个循环。内参基因β-actin正向引物为5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’，反向引物为5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’，产物103 bp。预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，40个循环。所有引物均由上海捷瑞生物公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用2-△△Ct比较法计算miR-21相对表达量。

1.2.4 血清 PTEN 蛋白质相对表达量 测定所有入组患者的血清标本中PTEN 蛋白。按ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪型号为Bio-Red 680，在波长为 450 nm处测定吸光度。

2 结 果

2.1 两组血清NT-proBNP水平和超声心动图检查结果比较 DCM组血清NT-proBNP水平和LVEDd均高于正常组(t=5.80、37.42，P值均<0.05)；LVEF、E/A均显著低于正常组(t=46.71、14.41，P值均<0.05)。见表1。

组别NNT-proBNP(ng/L)LVEDd(mm)LVEF(%)E/A正常20130.97±44.3039.10±2.2959.35±1.401.39±0.07DCM404 688.76±3 501.04①62.88±2.33①45.27±0.92①0.82±0.17①

与正常组比较：①P<0.05

2.2 血清miR-21相对表达量 DCM组miR-21相对表达量是正常组的(4.08±0.16)倍，差异有统计学意义(t=-88.12，P<0.05)。

2.3 miRNA表达量与各变量间的关系 Pearson线性相关分析显示，miR-21表达量与NT-proBNP和LVEDd呈正相关(r=0.977、0.616，P值均<0.05)，与LVEF和E/A呈负相关(-0.985、-0.884，P值均<0.05)。多重线性相关分析显示，血清miR-21表达量与LVEDd呈正相关(P<0.01)，见表2。

表2 miR-21表达量与各变量间的多重线性相关分析

2.4 血清 PTEN mRNA相对表达量 DCM组PTEN mRNA相对表达量是正常组的(0.27±0.03)倍，差异有统计学意义(t=91.52，P<0.05)。

2.5 PTEN mRNA表达量与各变量间的关系 Pearson线性相关分析显示，PTEN mRNA表达量与LVEF和E/A呈正相关(r=0.983，P<0.01和r=0.879，P<0.05)，PTEN mRNA表达量与LVEDd、NT-proBNP水平和miR-21表达量呈负相关(r=-0.977，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重线性相关分析显示，血清PTEN mRNA表达量与LVEF呈正相关(P<0.01)，与miR-21和NT-proBNP水平呈负相关(P值均<0.05),见表3。

表3 PTEN mRNA表达量与各变量间的多重线性相关分析

2.6 血清PTEN蛋白质相对表达量 DCM组PTEN蛋白质相对表达量是正常组的 (0.24±0.03)倍，差异有统计学意义(t=50.65，P<0.05)。

2.7 PTEN蛋白质相对表达量与各变量间的关系 Pearson线性相关分析显示，PTEN蛋白质表达量与LVEF和E/A呈正相关(r=0.984，P<0.01；r=0.879，P<0.05)，PTEN蛋白质表达量与LVEDd、NT-proBNP和miR-21表达量呈负相关(r=-0.978，P<0.05；r=-0.607，P<0.05和r=-0.998，P<0.01)。多重线性相关分析显示，血清PTEN蛋白质表达量与LVEF呈正相关(P<0.05)，与miR-21表达量和NT-proBNP水平呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 PTEN蛋白质表达量与各变量间的多重线性相关分析

3 讨 论

DCM是一种以心肌结构和功能重构为特征的特异性心肌病， 其发生不依赖于冠心病、 高血压和其他心脏疾病。其发病机制复杂，涉及心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心肌代谢紊乱、心肌微血管病变、心肌自主神经病变、细胞因子异常等，目前未被完全了解。目前,DCM尚无特异性治疗，一般采用控制血糖、抗心力衰竭等，疗效欠佳，预后差。

miRNA是真核生物中一种长度约为22个核苷酸大小、参与基因转录后调控的非编码单链小分子RNA，可特异性识别靶mRNA的3’-非编码区(3’-UTR)并与之结合，从而降解靶mRNA，抑制翻译，发挥其对基因的转录后表达调控，调节重要的细胞活动，参与众多疾病的病理生理过程[1]。近来研究表明，miRNA通过调控心肌细胞肥厚、凋亡、心肌纤维化、线粒体功能障碍、心室重构、内皮细胞修饰等方面在DCM的病理生理过程中发挥关键作用，干预miRNA可能会影响DCM的病情进展，未来可能成为DCM的治疗新靶向[2]。miR-21是其中一种由单个基因编码的、定位在染色体17q23.2，与编码跨膜蛋白的基因VMP1(或TMEM49)重叠，并独立地由miR-21前转录本(如pri-miRNA -21)中一个相对保守的启动子转录而成[6]的miRNA，其在心肌组织和许多主要的心血管细胞类型包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞和心脏成纤维细胞上高表达，在许多心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭、心脏肥大中呈差异性表达，参与各种心血管疾病的病理生理分子机制[2]。近年来miR-21在心血管生理和病理过程中的作用备受关注[7]。本研究结果显示，DCM血清NT-proBNP水平和LVEDd均显著高于正常组，LVEF和E/A均显著低于正常组；血清miR-21水平明显升高，且其表达水平与LVEDd、NT-proBNP呈正相关，与LVEF和E/A呈负相关，血清NT-proBNP水平升高，LVEF降低是心力衰竭的表现；LVEDd增大是心室重构的大体表现，基因分子水平表现为多种细胞因子水平异常、信号转导通路调控异常等。提示血清miR-21很可能参与DCM的发生发展，未来可能成为DCM危险分层的新诊断标志物和潜在的治疗新靶点。

miR-21介导的心血管效应的靶基因，分别为PDCD4、PTEN、SPRY1和SPRY2，这4个靶基因具有明显细胞和条件特异性[8]。PTEN基因在胚胎发育，细胞生长、分化、凋亡和迁移的调控中发挥重要作用。Oudit等[9]发现，miR-21通过调控PTEN/AKT通路延缓心室重构和心力衰竭的进展。Yang等[10]发现，曲美他嗪能激活PTEN/Akt信号通路上调miR-21的表达从而抑制缺血再灌注导致的心肌损伤。Tao等[11]发现，生长抑制因子-5可能通过调控miR-21的表达来抑制心肌纤维化，PTEN/Akt通路可能参与其中。Haque等[12]发现，miR-21可能通过调控PTEN/Akt通路水平对糖尿病视网膜病变发挥潜在性的靶向治疗作用。Wang等[13]发现，过表达子宫内膜间充质干细胞的miR-21水平可能通过调控PTEN/Akt通路对心肌细胞起保护作用。Shi等[14]发现，miR-21可能通过调控PTEN/PI3K/Akt通路促进心肌干细胞的增殖，未来可能对缺血性心脏病的治疗发挥潜在作用。本研究结果发现，DCM组血清PTEN mRNA和蛋白质表达量均明显降低，且与LVEF和E/A呈正相关，与LVEDd、NT-proBNP、miR-21表达量呈负相关。因此推测，在DCM中，高表达的miR-21可能通过与PTEN基因结合，负性调节PTEN的表达，发生转录后基因沉默，在翻译水平抑制靶基因的表达，在DCM的病理生理机制中发挥重要作用。