miR-17-92通过靶向抑制QKI促进结直肠癌转移

肖慧敏，柳青峰，臧辉，肖明明，孙田，褚飞，祖富强

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是当今世界上最常见的恶性肿瘤和导致人类死亡的原因之一，在世界范围内的发病率较高。在我国，结直肠癌的发病率更是呈逐年上升趋势，严重威胁国人生命健康[1]。结直肠癌是一个多基因、多阶段、长期形成的复杂的病变过程。目前为止，结直肠癌细胞的恶性生物学行为的调控机制仍未完全明确。近年来对非编码基因组序列的研究揭示，微小RNA (MicroRNAs, miRNAs)在肿瘤的发病机制中发挥着作用。许多miRNAs存在于结直肠癌肿瘤组织和血液中, 并对其发生、发展产生重要影响[2]。miR-17-92 基因簇是一个高度保守的基因簇，由6个miRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a)组成[3]，由于它与多种实体瘤的发生密切相关而受到广泛关注。已有研究表明，miR-17-92簇中的6个miRNA均在CRC肿瘤组织中表达增加(相比于正常组织)[4]。RNA结合蛋白QKI蛋白影响细胞的增殖和组织器官的分化，与其在恶性肿瘤中的作用密切相关[5]。由RNA结合蛋白和miRNAs所介导的转录后调控已经成为基因调控的主要方式，对疾病的演变、癌变的发生等具有重要意义[6]。本研究通过qRT-PCR、Western blot探讨miR-17-92和QKI在结直肠癌中的表达关系，并通过转染结肠癌SW480细胞过表达miR-20a和共转染过表达QKI，检测细胞的迁移能力，探讨miR-17-92和QKI对结直肠癌转移的调控机制，为结直肠癌的临床诊断和靶向治疗提供新的依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源： 收集2017年1月—2017年12月就诊于辽宁省人民医院具有完整临床资料的CRC患者新鲜手术切除标本及新鲜癌旁组织29例，置于液氮中冷冻保存，用于qRT-PCR检测。29例患者术后病理均证实为腺癌。人结直肠癌细胞系SW480购自中科院上海细胞库，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。

1.1.2 主要试剂： QKI兔抗人多克隆抗体购自美国Proteintech公司。RNA分离试剂盒Trizol、逆转录试剂盒(DRR037S)、SYBR Green II实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司，转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。miR-20a和内参U6的qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司设计合成， miR-20a模拟物、miRNA模拟物阴性对照均由上海吉玛公司合成。pCMV6-Myc-DDK、pCMV6-Myc-DDK-QKI(RC205779)均购自OriGene公司。

1.2 实验方法

1．2.1 qRT-PCR： 采用RNA分离Trizol试剂盒提取并纯化总RNA，根据Takara逆转录和扩增试剂盒说明书进行逆转录和扩增。反应条件：95℃变性5 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环，均设立复孔进行重复。以DEPC水代替模板cDNA作为阴性对照。反应完成后得到标本中靶基因的阈值循环数(CT)值，与对应U6的CT值相减，得到校正CT值。以正常癌旁组织为对照，计算癌组织的相对表达值。癌组织/癌旁组织=2-ΔΔct；ΔΔct=(Δct癌组织目的基因-Δct癌组织内参基因)-(Δct癌旁组织目的基因-Δct癌旁组织内参基因)。

1.2.2 Western Blot： 收集细胞，PBS 重悬，低温离心(4℃， 2 000 r/min)5 min,弃去 PBS，干燥洁净滤纸轻柔吸净其余液体。用4 ℃预冷的裂解缓冲液处理胞，冰上25 min，期间反复混匀裂解液，低温高速离心(4℃，12 000 r/min)20 min，取其上清液，以提取总蛋白。经BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，样品均定量为同一水平，利用10%的SDS-PAGE电泳，并转印至PVDF膜(提前浸泡甲醇溶液中进行膜软化)。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5 h。采用ECL发光方法，并用Bioimaging system采集发光信号。

1.2.3 细胞转染技术： 用Lipofectamine 3000(美国Invitrogen)转染试剂进行转染，根据试剂说明书进行配液及转染或干扰相关实验。6 h后采用10%胎牛血清的培养基进行换液。转染后48 h收集细胞，并通过qRT-PCR及Western blot验证转染效率。

1.2.4 迁移实验(Transwell 法): SW480转染miR-20a模拟物和QKI过表达质粒后24 h，常规消化至单个细胞，重悬并重新计算细胞数目，调整单个的细胞密度变为10×104/ml，取其中的300 μl细胞悬液用移液器分别加至未铺有和铺有基质胶的Transwell上室，下室加入600 μl含有20%FBS的新鲜培养基，48 h后，取出小室，棉签轻轻擦净Transwell小室上室上层细胞，冰甲醇固定30 min，弃去冰甲醇，待其挥发净后，0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗至清洁，晾干，显微镜下每孔任意选取3个200×视野拍照，并进行计数，取其平均值进行分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量数据均采用3次以上的独立实验获得，符合正态分布的用平均值±标准差表示，组间比较采用配对t检验；计数数据用频率表示，组间比较采用χ2检验。mRNA和蛋白表达的相关性采用Pearson相关系数分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-20a在肠癌和癌旁组织中的表达 qRT-PCR检测29例结直肠癌患者中肠癌组织和癌旁正常组织miR-20a的表达水平。结果显示，在29例患者中25例(86.21%)腺癌组织miR-20a表达较癌旁组织上调,4例(13.79%)肠癌组织miR-20a表达较癌旁组织下调，差异有统计学意义(t=4.099,P=0.000)。

2.2 QKI蛋白在肠癌和癌旁组织中的表达 Western blot检测29例结直肠癌患者中肠癌组织和癌旁正常组织中QKI蛋白表达水平。结果显示，23例(79.31%)腺癌组织中QKI蛋白表达明显低于癌旁正常组织(t=3.037,P=0.005)，见图1。

注：N 1-4.癌旁组织； T 1-4.腺癌组织

2.3 miR-20a和QKI蛋白在肠癌和癌旁组织中表达关系 Pearson相关系数分析显示，miR-20a与QKI蛋白表达呈负相关(r=-0.437，P=0.018)。

2.4 过表达miR-20a可下调QKI蛋白的表达 在结肠癌SW480细胞转染miR-20a模拟物后，采用qRT-PCR技术验证其转染效率，采用Western blot检测细胞内的QKI蛋白表达水平。结果显示，过表达miR-20a后，细胞内QKI蛋白表达显著减少；在共转染QKI过表达质粒后，QKI蛋白表达水平有所回升，见图2、图3。

2.5 miR-20a和QKI共同影响结直肠癌的转移 Transwell迁移实验结果表明，过表达miR-20a后，SW480细胞的迁移数目显著增多(P<0.05),这种增强作用在共转染QKI过表达质粒后有所减弱，图4见封3。

注：与Blank、miR-ctrl比较，aP<0.05

3 讨 论

微小RNAs是一类长度为20～25个核酸的内源性非编码单链RNA，进化上高度保守[7-8]。miRNAs本身不翻译成蛋白质[9-10]，在原核、真核生物中主要参与转录后基因表达[11]，其起作用的方式是与靶基因的mRNA完全或者部分配对，介导靶基因mRNA直接降解或者抑制其编码蛋白质的翻译，从而调节多种生物学过程，包括细胞增殖、细胞分化、细胞侵袭、细胞迁移、细胞调亡和周期调控等[12-15]。2004年，miR-17-92基因簇在弥漫性大B细胞淋巴瘤中首次被报道为癌基因[16]。并很快被证实其作为c-myc的下游，并与E2F转录网形成自循环体系，调控细胞增殖[17-19]。已有研究证实，在大肠癌中，miR-17-92基因簇通过抑制E2F1的翻译促进癌细胞的增殖[20]。本研究证实miR-17-92基因簇在结直肠癌组织中较正常结直肠组织呈高表达。并通过进一步的研究发现miR-17-92基因可增强结肠癌SW480细胞的迁移能力，从而促进结直肠癌的转移。

注：与miR-ctrl比较，aP<0.05；与miR-20a+vec比较，bP<0.05

RNA结合蛋白QKI是信号转导与RNA活化蛋白(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族中的一员，主要包含 QKI-5、QKI-6 和 QKI-7等3个亚型[21-22]。QKI是一个重要的转录后调控因子，通过结合下游靶分子在转录后多个层次对靶基因的表达进行调节，如增强mRNA的稳定性、抑制蛋白的翻译、调控mRNA的可变剪接[23-25]。过表达QKI-5和QKI-6均可以增强内源性β-catenin在细胞膜的表达水平，降低其在细胞浆和细胞核的分布，抑制β-catenin的转录活性，阻断Wnt信号通路，从而抑制细胞增殖，促进肠道上皮细胞的分化[26]。有研究表明，QKI启动子甲基化及QKI mRNA表达降低可能是结直肠癌发生、发展的重要原因[27]。另有研究显示，比对不同分化水平的直肠癌组织，随着分化程度的不断降低而QKI-5的表达水平也随之降低，且与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、远端转移、肿瘤标志物CEA水平密切相关[28]。本研究证实QKI在结直肠癌组织中较正常结直肠组织呈低表达。在此基础上，发现miR-17-92基因簇与QKI在结直肠癌组织中的表达呈负相关关系。并且通过细胞转染，利用Western blot检测和Transwell迁移实验，进一步揭示了miR-17-92基因簇可通过下调转录后调控因子QKI，增强结直肠癌细胞的迁移能力，从而促进结直肠癌的转移。为临床提供了一个结直肠癌潜在的诊断和治疗靶点。

利益冲突：无

作者贡献声明

肖慧敏：设计研究方案，实施研究过程，统计学分析，论文撰写，论文修订；柳青峰：课题设计，论文审核；臧辉、肖明明：提出研究方向、研究思路，论文修订；孙田、褚飞、祖富强：文献调研与整理，论文撰写