病毒性心肌炎患儿血清miR-133及miR-155水平的表达及临床意义

邓国清，鲁利群，杨欣，贺静，王旭，黄莉

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由亲心肌细胞病毒感染引起的心肌细胞炎性反应，常见病毒包括柯萨奇B组病毒、巨细胞病毒及肠病毒等的感染均可导致VMC[1]。VMC患儿临床表现不一，严重时可引起心力衰竭、心源性休克等并发症，危及患儿生命[2]。微小RNA(micro RNAs，miRNA)是一类小的内源性非编码RNA，长度18～25个核苷酸，miRNA可以通过与信使RNA(mRNAs)结合以阻止蛋白质翻译，并在转录或转录后下调基因表达，其在多种生物过程中发挥重要作用，如细胞增殖分化、炎性反应、肿瘤、免疫等病理生理过程的调控[3]。近年来有研究表明，某些miRNA的异常表达，如miR-133、miR-155等，与心肌炎、动脉粥样硬化等多种心血管疾病有关[4]，检测患者循环血中miRNA表达水平有助于对疾病严重程度的判断以及治疗方式的选择[5-6]。miR-133定位于人类第6号染色体上，是一个多功能miRNA；miR-155定位于人染色体21q21，其由B细胞整合族第3个外显因子的高度保守区域编码而成。本研究通过检测VMC患儿血清中miR-133、miR-155的表达水平，并分析两者与VMC患儿心肌损伤、炎性因子及免疫功能等指标的相关性，以初步探讨其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月—2018年6月成都医学院第一附属医院儿科收治的急性期VMC患儿97例作为病例组，根据左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnI)结果，将病例组分为轻度VMC亚组和重度VMC亚组，其中轻度VMC亚组(LVEF≥50%，cTnI≤0.1 ng/ml)56例，男31例，女 25例；年龄1～12(6.25±1.18)岁；病程2～15(8.21±5.10)d；诱因：上呼吸道感染32例，肠道感染14例，原因不明10例；临床症状：乏力27例，心悸16例，多汗13例；合并心力衰竭2例，合并严重心律失常1例。重度VMC亚组(LVEF<50%，cTnI>0.1 ng/ml)41例，男25例，女16例；年龄11个月～11岁(6.11±1.26)岁；病程2～17(9.13±4.80)d；诱因：上呼吸道感染23例，肠道感染11例，原因不明7例；临床症状：乏力21例，心悸11例，多汗9例；合并心力衰竭2例，合并严重心律失常4例。另选取同期于医院进行健康体检的健康儿童40例作为健康对照组，其中男24例，女16例，年龄11个月～12岁。3组儿童的性别、年龄等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准通过，全部患儿家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①所有患儿均符合中华医学会制定的VMC诊断标准[7]，包括存在心功能不全、心源性休克，影像学存在心脏扩大、异常的心电图改变，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)或cTnI升高，病原学检查呈阳性；②患儿年龄≤12岁。(2)排除标准：①由先天性心脏病、风湿性心肌炎及代谢性疾病导致的心肌损害患儿；②合并肝肾等系统疾病患儿；③既往有VMC病史或家族史的患儿。

1.3 观测指标与方法 分别于VMC患儿入院次日以及健康对照组儿童健康体检时抽取受试儿童晨起空腹静脉血5 ml待测。

1.3.1 免疫指标检测：上述血样2 ml置于EDTA抗凝管中，采用流式细胞仪(美国BD公司)检测血浆CD4+、CD8+水平，并计算CD4+/CD8+值。

1.3.2 心肌损伤与炎性因子指标检测：上述血样3 ml室温下静置0.5 h后，离心取上清液，部分置于-20℃冰箱保存待检。采用酶联免疫吸附法(试剂盒购自北京北方免疫试剂研究所)检测血清CK-MB、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、白介素-21(IL-21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteine aspartate proteolytic enzyme，Caspase-3)、可溶性凋亡相关因子配体(soluble apoptosis-related factor ligand，sFasL)水平，采用电化学发光法(试剂盒购自美国Spectral Diagnostics公司)检测血清cTnI水平，以上操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 血清miR-133与miR-155表达水平检测：余部分血清置于EP管中，保存于-80℃冰箱，应用miRNeasy Serum试剂盒(德国QIAGEN公司)提取血清中总RNA，采用紫外分光光度计鉴定RNA提纯液纯度后，将样本保存于-80℃冰箱。应用荧光实时定量PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)在荧光定量PCR仪器(ABI 7000)上进行PCR反应。miR-133特异性正向引物序列：5'-TTGGTCCCCTTCAACCAGCTGT-3'，miR-155正向引物序列：5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3'，内参基因U6上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，通用的下游引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。反应体系： SYBR Green Mix 10 μl， cDNA模板2 μl，无RNA酶水4 μl，引物2 μl。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，每个样本重复3次。应用相对定量法对结果进行分析，以2-ΔΔCt法计算血清miR-133与miR-155的相对表达量。

2 结 果

2.1 免疫功能、心肌损伤、炎性因子指标比较 与健康对照组比较，重度VMC亚组患儿CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-17、IL-21水平明显升高，而血浆CD4+、CD4+/CD8+、IL-10明显降低(P<0.05)，轻度VMC亚组患儿CD8+、CK-MB、 sFasL、Caspase-3、 IL-17、IL-21水平明显升高，而IL-10水平明显降低(P<0.05)；与轻度VMC亚组患儿比较，重度VMC亚组患儿CK-MB、cTnI、sFasL水平明显升高，而CD4+水平明显降低(P<0.05)；余指标3组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 血清miR-133和miR-155表达水平比较 与健康对照组比较，重度VMC亚组、轻度VMC亚组血清miR-133表达水平明显降低，miR-155表达水平明显升高(P<0.05)；与轻度VMC亚组患儿比较，重度VMC亚组患儿血清miR-133表达水平明显降低，miR-155表达水平明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组血清miR-133和miR-155表达水平比较

2.3 血清miR-133、miR-155的表达与各指标的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，VMC患儿血清miR-133的表达与CD4+/CD8+呈正相关，与CK-MB、cTnI呈负相关(P<0.01)，与CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21无明显相关性(P>0.05)；miR-155的表达与CD4+/CD8+呈负相关，与CK-MB、cTnI呈正相关(P<0.05)，与CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21无明显相关性(P>0.05)，见表3。

表1 各组心肌损伤、炎性因子及免疫功能指标比较

表3 VMC患儿血清miR-133、miR-155的表达

3 讨 论

血清中生物标志物的检测是诊断心血管疾病的重要手段。近年来研究表明，miRNA参与了心血管疾病的发生、发展，循环中的miRNA具有灵敏度高、稳定、序列保守等优点，是一种可应用于心血管疾病诊断和预后评估的生物标志物[8]。VMC患儿血清中存在多种miRNA异常表达的现象，如在心力衰竭患者中，miR-133可以抑制ERG基因中 mRNA和蛋白质水平的表达，调节ERG编码的钾离子通道的表达，抑制病理性QT间期延长，从而可以抑制心肌的电生理重塑，进而发挥保护性作用[9-10]。有研究表明，VMC患儿血清miR-133表达调控功能失常，患儿易发生恶性心律失常及心功能下降[11]。miR-155在多种心血管疾病中均存在异常表达的现象，如在急性心肌梗死动物模型中，活化巨噬细胞的外泌体中miR-155的表达增加，富含miR-155的外泌体可以抑制成纤维细胞增殖并促进成纤维细胞炎性反应，而敲除miR-155可以明显降低急性心肌梗死后心脏破裂的发生率[12]。此外，在VMC大鼠中，血清miR-155表达上调，而在敲除miR-155后，心肌细胞的损伤及炎性反应减轻，心脏功能失调也明显减轻[13]。上述研究表明miR-133、miR-155的表达可能与VMC的发生、发展存在一定关联。

本结果显示， VMC患儿与健康对照组间CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21水平有明显差异，表明机体的免疫功能、心肌损伤、炎性因子的异常与VMC的发生、发展关系密切。当发生VMC时，患儿体内的单核巨噬细胞、T淋巴细胞介导的细胞免疫及IL-10、IL-17、IL-21等细胞因子可以形成复杂的炎性反应调控网络，其参与了VMC过程中炎性反应的发生发展[14]。另外，患儿一旦发生VMC，病毒感染将促使单核细胞等免疫细胞释放大量细胞因子，从而可以促进心肌细胞表面CD54表达，进而造成淋巴细胞黏附及氧自由基介导的损伤。

本研究中，VMC患儿血清miR-155表达水平明显高于健康对照组，且重度VMC患儿血清miR-155表达水平明显高于轻度VMC患儿，结果表明VMC患儿血清miR-155表达水平上调，其表达水平上调程度与疾病的严重程度有关。目前VMC患儿血清miR-155水平上调机制尚不清楚，可能与炎性反应微环境中某些物质通过激活促炎细胞因子的产生有关。miR-155表达上调后可影响免疫细胞的功能，其可促进巨噬细胞向M2型极化，从而可以发挥抑制免疫的功能。有研究表明，VMC期间的心脏损伤不是由病毒对心肌细胞的直接细胞毒作用引起，而是通过诱导免疫应答对心肌细胞进行损伤[15-16]。本研究中进一步分析了VMC患儿血清miR-155与各指标间的相关性，结果显示，VMC患儿血清miR-155的表达与CD4+/CD8+呈负相关。miR-155可能通过抑制免疫细胞如Treg、Th17细胞的活化，影响IL-4、IL-10等细胞因子的分泌，从而发挥免疫抑制的作用。另外，miR-155的表达与CK-MB、cTnI呈正相关，表明miR-155的表达与患者心功能损伤的严重程度有关，其有可能成为评价心肌损伤严重程度的指标。国内学者亦报道VMC患儿外周血中高表达miR-155能够造成心肌细胞损伤及凋亡[17]。

miR-133特异性表达于心肌与骨骼肌中，包括miR-133a和miR-133b等2种类型，其参与了调控心肌细胞的分化、增生、肥大及凋亡，并能影响心肌细胞钙离子通道的功能，维持正常心肌细胞动作电位复极化[18]。本研究中，VMC组患儿血清miR-133表达水平明显低于健康对照组儿童，且重度VMC亚组患儿血清miR-133表达水平明显低于轻度VMC亚组，表明VMC患儿血清miR-133表达水平下降，且其表达水平下降程度与疾病的病情严重程度有关。分析其可能原因为当患儿发生VMC时，肌细胞分化的关键因子，如肌细胞增强因子-2、肌原性分化因子-1等减少，从而导致以上因子调控miR-133的转录作用下降，进而使得miR-133表达水平下降[19]。另外，当患儿发生VMC时，转录因子CASP9的表达下降，也可导致miR-133的表达下降[20]。有研究表明，正常心肌细胞中miR-133能抑制血清反应因子(serum response factor，SRF)的激活，而VMC患儿心肌细胞中miR-133表达下调，结合在启动子调控区的SRF被激活，从而促进了心肌细胞特异性生长和分化因子的表达，进而促使心肌细胞肥大，结构重塑[21]。此外，miR-133水平降低后，其丧失了对肌成纤维细胞的Cyclin D1的抑制作用，肌成纤维细胞将过度增殖，从而促进间质纤维化形成[21]。本研究中，VMC患儿血清miR-133的表达与CD4+/CD8+呈正相关，与心肌损伤指标CK-MB、cTnI呈负相关，表明miR-133同样参与了VMC中炎性反应免疫调控，影响心肌细胞损伤的过程[22]。

综上所述，VMC患儿血清miR-133表达水平降低，而miR-155表达水平升高，两者均与部分心肌损伤及免疫功能指标存在相关性，其参与了VMC发生、发展的过程，检测VMC患儿血清miR-133和miR-155表达水平可能有助于疾病诊断、病情严重程度判断。

利益冲突：无

作者贡献声明

邓国清：提出研究方向、研究思路、研究选题；鲁利群：设计研究方案、研究流程；杨欣：实施研究过程，数据收集，分析整理；贺静：进行文献调研与整理；王旭：设计论文框架，撰写论文；黄莉：起草论文、修订论文、论文终审