急性脑梗死患者血清微小RNA-145、程序性细胞死亡因子4 mRNA水平变化及诊断价值研究

高倩，王建宇，孟伟建，李静，崔永健，魏琰

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）又称急性缺血性脑卒中，是指多种原因引起的脑部血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，并伴有不同程度的神经功能缺损，是脑血管疾病最常见的类型［1］。ACI发病率、致残率均较高，可威胁患者健康，故早期诊断ACI有助于临床针对性治疗方案的制定，从而改善患者预后［2］。目前ACI的诊断主要依靠CT、MRI及相关量表，具有一定局限性，而寻找相关血清生物标志物可能有助于ACI的早期诊断［3］。微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）可通过介导氧化应激、血管生成等在脑血管疾病进展中发挥关键作用［4］。研究发现，血清miR-145水平降低与老年脑梗死患者颈动脉狭窄程度密切相关［5］。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一类细胞死亡因子，其可阻断含5'非翻译区（5' untranslated region，5'UTR）结构域的mRNA的翻译过程，参与细胞增殖、凋亡等多种生物学过程［6］。研究发现，miR-145靶向下调PDCD4水平可缓解缺血性脑卒中引起的炎性反应［7］。但PDCD4是否可作为ACI的诊断指标尚有待研究。因此，本研究分析ACI患者血清miR-145、PDCD4水平，并探讨二者单独及联合检测对ACI的诊断价值，以期为临床上ACI的早期诊断提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019年1月至2020年6月衡水市人民医院神经内科收治的ACI患者185例为ACI组，其中男98例、女87例，年龄42～78岁、平均年龄（61.2±8.6）岁。纳入标准：（1）符合ACI的诊断标准［2］；（2）经颅脑CT、MRI检查确诊为ACI；（3）首次发病，且于发病24 h内就诊；（4）具有ACI所致神经功能缺损等症状；（5）患者或家属签署知情同意书。排除标准：（1）合并心、肝、肾等重要脏器功能不全者；（2）伴有血液病、自身免疫性疾病者；（3）伴有急、慢性感染者；（4）合并恶性肿瘤者；（5）近期使用激素或免疫抑制剂者。根据入院时美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）［8］评分将ACI患者进一步分为轻度损伤亚组（NIHSS评分≤15分，72例）、中度损伤亚组（NIHSS评分为16～29分，64例）、重度损伤亚组（NIHSS评分≥30分，49例）。根据ACI患者脑梗死体积大小，将其进一步分为小体积亚组（脑梗死体积＜5 cm3，69例）、中等体积亚组（脑梗死体积为5～10 cm3，62例）、大体积亚组（脑梗死体积＞10 cm3，54例）［9］。同期选择在本院体检的健康者150例为对照组，其中男82例、女68例，年龄40～79岁、平均年龄（60.8±9.1）岁。纳入标准：（1）对本研究知情同意；（2）临床资料完整。排除标准：存在沟通障碍者。本研究经衡水市人民医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 收集所有受试者一般资料，包括性别、年龄、吸烟史（近半年内每日吸烟≥1支定义为有吸烟史）、饮酒史（每周饮啤酒、白酒等含有酒精成分的饮料≥1次，且连续时间至少半年定义为有饮酒史）、疾病史（高血压、糖尿病、高脂血症史）和入院/体检时收缩压、舒张压及三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸、胱抑素C水平。

1.2.2 血清miR-145、PDCD4 mRNA水平检测 采集ACI患者入院次日清晨、对照组体检当日清晨的外周静脉血3 ml，于4 ℃下3 000 r/min离心15 min（离心半径10 cm），转移血清至新离心管中，于-80 ℃冰箱中保存待用。采用实时荧光定量PCR检测血清miR-145、PDCD4 mRNA水平。按照上海通蔚生物科技有限公司生产的Trizol试剂盒中的方法提取血清总RNA，并通过核酸定量检测仪（上海净信实业发展有限公司生产）检测其浓度和纯度，随后按照武汉科昊佳生物科技有限公司生产的反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录为cDNA。miR-145、PDCD4 mRNA及内参U6、β-actin的引物均由上海赛百盛基因技术有限公司合成，见表1。PCR反应条件为95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，共40个循环。反应结束后，利用公式2-∆∆Ct计算血清miR-145、PDCD4 mRNA水平。

表1 miR-145、PDCD4 mRNA及内参U6、β-actin的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-145，PDCD4 mRNA and internal reference U6 and β-actin

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用 χ2检验；ACI患者血清miR-145水平与血清PDCD4 mRNA水平间的相关性分析采用Pearson相关分析；ACI影响因素分析采用多因素Logistic回归分析；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平对ACI的诊断价值，计算曲线下面积（area under curve，AUC），确定最佳截断值，计算灵敏度、特异度，AUC的比较采用Z检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与ACI组一般资料比较 对照组与ACI组性别、年龄、吸烟史、饮酒史、有糖尿病史者所占比例、有高脂血症史者所占比例、三酰甘油、总胆固醇、HDL-C比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；ACI组有高血压史者所占比例、收缩压、舒张压、LDL-C、同型半胱氨酸、胱抑素C高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 对照组与ACI组一般资料比较Table 2 Comparison of general data between control group and ACI group

2.2 对照组与ACI组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较ACI组血清miR-145水平低于对照组，血清PDCD4 mRNA水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 对照组与ACI组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels between control group and ACI group

表3 对照组与ACI组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels between control group and ACI group

组别 例数 miR-145 PDCD4 mRNA对照组 150 1.00±0.26 1.01±0.28 ACI组 185 0.59±0.17 1.44±0.39 t值 17.358 11.339 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 轻度损伤亚组、中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较 轻度损伤亚组、中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145水平低于轻度损伤亚组，血清PDCD4 mRNA水平高于轻度损伤亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；重度损伤亚组血清miR-145水平低于中度损伤亚组，血清PDCD4 mRNA水平高于中度损伤亚组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 轻度损伤亚组、中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in mild injury subgroup，moderate injury subgroup and severe injury subgroup

表4 轻度损伤亚组、中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 4 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in mild injury subgroup，moderate injury subgroup and severe injury subgroup

注：a表示与轻度损伤亚组比较，P＜0.05；b表示与中度损伤亚组比较，P＜0.05

组别 例数 miR-145 PDCD4 mRNA轻度损伤亚组 72 0.72±0.19 1.31±0.35中度损伤亚组 64 0.60±0.18a 1.45±0.38a重度损伤亚组 49 0.43±0.12ab 1.62±0.44ab F值 42.143 9.443 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 小体积亚组、中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较 小体积亚组、中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145水平低于小体积亚组，血清PDCD4 mRNA水平高于小体积亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）；大体积亚组血清miR-145水平低于中等体积亚组，血清PDCD4 mRNA水平高于中等体积亚组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 小体积亚组、中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 5 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in small volume subgroup，medium volume subgroup and large volume subgroup

表5 小体积亚组、中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比较（±s）Table 5 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in small volume subgroup，medium volume subgroup and large volume subgroup

注：a表示与小体积亚组比较，P＜0.05；b表示与中等体积亚组比较，P＜0.05

组别 例数 miR-145 PDCD4 mRNA小体积亚组 69 0.69±0.18 1.33±0.34中等体积亚组 62 0.57±0.16a 1.47±0.39a大体积亚组 54 0.40±0.11ab 1.65±0.42ab F值 52.662 10.657 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 ACI患者血清miR-145水平与血清PDCD4 mRNA水平间的相关性 Pearson相关分析结果显示，ACI患者血清miR-145水平与血清PDCD4 mRNA水平呈负相关（r=-0.327，P＜0.001），见图1。

图1 ACI患者血清miR-145水平与血清PDCD4 mRNA水平间相关性的散点图Figure 1 Scatter plot of correlation between serum miR-145 level and serum PDCD4 mRNA level in patients with ACI

2.6 ACI影响因素的多因素Logistic回归分析 以受试者是否发生ACI作为因变量（赋值：未发生=0，发生=1），以高血压史（赋值：无=0，有=1）、收缩压（赋值：实测值）、舒张压（赋值：实测值）、LDL-C（赋值：实测值）、同型半胱氨酸（赋值：实测值）、胱抑素C（赋值：实测值）、血清miR-145水平（赋值：实测值）、血清PDCD4 mRNA水平（赋值：实测值）作为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示，胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平是ACI的影响因素（P＜0.05），见表6。

表6 ACI影响因素的多因素Logistic回归分析Table 6 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of ACI

2.7 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平对ACI的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，血清miR-145水平联合血清PDCD4 mRNA水平诊断ACI的AUC大于胱抑素C（Z=2.421，P=0.015）、血清miR-145水平（Z=3.605，P<0.001）、血清PDCD4 mRNA水平（Z=2.954，P=0.003）单独诊断ACI的AUC，差异有统计学意义，见表7、图2。

图2 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平诊断ACI的ROC曲线Figure 2 ROC curve of cystatin C，serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in the diagnosis of ACI

表7 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平对ACI的诊断价值Table 7 Diagnostic value of cystatin C，serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in ACI

3 讨论

随着社会的发展和人们饮食习惯的改变，ACI发病率呈上升趋势且趋向年轻化，威胁人们健康。ACI的诊疗重点在于早发现、早治疗、早预防，需要在短时间内对疾病做出准确、快速的诊断［10］。目前，临床上主要依靠影像学检查和医生临床经验对ACI进行诊断，然而CT检查诊断早期ACI的灵敏度欠佳，MRI检查耗时长、费用高，医生临床经验缺乏客观性，因而选取有效的生物标志物可能有助于临床上ACI的诊断。

微小RNA是一类非编码内源性小RNA，可通过抑制转录或降解mRNA而参与、调控脑血管疾病的发展进程。近年来，越来越多的研究证实，微小RNA表达水平在ACI患者中升高或降低［11-12］。miR-145定位于5q32-33，其在缺血性脑卒中进展过程中发挥重要的调控作用，如miR-145可通过调控丝裂原活化蛋白激酶通路而保护缺血性脑卒中大鼠的神经干细胞［13］。本研究结果显示，ACI组血清miR-145水平低于对照组；中度损伤亚组、重度损伤亚组血清miR-145水平低于轻度损伤亚组，重度损伤亚组血清miR-145水平低于中度损伤亚组；中等体积亚组、大体积亚组血清miR-145水平低于小体积亚组，大体积亚组血清miR-145水平低于中等体积亚组；提示血清miR-145水平降低可能与ACI发病及病情严重程度有关。PDCD4是在细胞凋亡过程中发现的一种特定调节基因，其表达水平在多种细胞凋亡过程中明显升高，如梁丽英等［14］研究报道，微小RNA-21可通过靶向调控PDCD4而抑制心肌细胞凋亡。此外，REN等［15］研究发现，微小RNA-424通过靶向PDCD4可减轻缺血性脑卒中细胞模型中的神经元损伤。本研究结果显示，ACI组血清PDCD4 mRNA水平高于对照组，提示血清PDCD4 mRNA水平可能参与ACI的发病过程。进一步研究发现，中度损伤亚组、重度损伤亚组血清PDCD4 mRNA水平高于轻度损伤亚组，重度损伤亚组血清PDCD4 mRNA水平高于中度损伤亚组；中等体积亚组、大体积亚组血清PDCD4 mRNA水平高于小体积亚组，大体积亚组血清PDCD4 mRNA水平高于中等体积亚组；提示血清PDCD4 mRNA水平可能在ACI病情进展中发挥重要作用。

刘宏伟等［7］通过生物信息学预测发现，PDCD4是miR-145的靶基因，通过过表达miR-145靶向下调PDCD4可抑制缺血性脑卒中的病情进展。本研究Pearson相关分析结果表明，ACI患者血清miR-145水平与血清PDCD4 mRNA水平呈负相关，提示miR-145与PDCD4 mRNA可能相互作用并参与ACI的病情进展过程。推测miR-145可通过靶向PDCD4而抑制肿瘤坏死因子α、白介素6的表达及调节细胞凋亡，从而在ACI病情进展中发挥作用［7］。本研究多因素Logistic回归分析结果显示，胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平是ACI的影响因素，提示检测胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平可能对早期评估ACI有帮助。研究发现，异常升高的血清胱抑素C与ACI的发生密切相关，可作为诊断ACI的常规指标［16］。本研究ROC曲线分析结果显示，血清miR-145水平联合血清PDCD4 mRNA水平诊断ACI的AUC大于胱抑素C、血清miR-145水平、血清PDCD4 mRNA水平单独诊断ACI的AUC，提示临床上通过联合检测血清miR-145、PDCD4 mRNA水平可能更有利于早期诊断ACI。

综上所述，ACI患者血清miR-145水平下降、血清PDCD4 mRNA水平升高，其均与患者神经功能缺损程度和脑梗死体积有关，且二者联合对ACI具有较高的诊断价值，其可能是临床上早期诊断ACI的潜在生物标志物。但由于本研究属于单中心小样本研究，结果可能存在一定局限性，下一步需要扩大样本量，进一步探讨血清miR-145、PDCD4 mRNA水平在ACI早期诊断中的价值。

作者贡献：高倩进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、结果的分析与解释，撰写论文，对文章整体负责、监督管理；王建宇、魏琰进行数据收集与整理；孟伟建进行统计学处理；高倩、李静进行论文的修订；高倩、崔永健负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。