邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对秀丽线虫生殖能力的影响

岳 营，李晶晶，屈 满，邱月秀，刘 冉，尹立红，李云晖*

(东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]，是聚氯乙烯产品中应用最广泛的增塑剂[1]，对环境和人类健康具有潜在的风险[2-3]，现已被我国列为优先监测的环境污染物。DEHP作为环境内分泌干扰物具有类雌激素作用，在人体内主要通过发挥类雌激素和抗雄激素作用对人体造成危害，主要的危害靶器官是生殖系统[4]，其中DEHP的雌性生殖毒性越来越受到关注。有研究报道，DEHP会严重影响卵泡的生长发育导致卵泡中卵母细胞核消失，随着暴露剂量的增加出现闭锁卵泡且颗粒细胞发生脱落以及排列紊乱等病理变化，从而使成熟卵泡减少[5]。但是，目前有关DEHP在卵子发生阶段的毒性研究报道较少。

秀丽线虫作为一种优秀的模式生物已广泛应用于生殖毒性评价中[6]。秀丽线虫不同时期的生殖细胞在生殖腺中整齐排列并且位置保持相对固定，从顶体细胞开始依次是有丝分裂区、过渡区(transition zone，TZ)、减数分裂区，其中减数分裂区依次是细线期、偶线期、粗线期、双线期以及终变期，并且各区形态不同，界限分明[7]。可以结合位置和形态在显微镜下观察有丝分裂区和减数分裂区生殖细胞连续的变化过程，所以秀丽线虫是良好的观察卵子发生过程的模型[8-9]。本研究观察了DEHP对秀丽线虫后代数目、有丝分裂期和减数分裂期生殖细胞数、粗线期细胞凋亡数的影响，为进一步探讨其影响卵子发生的机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 秀丽线虫虫株与培养方法

N2、MD701｛bcIs39[lim-7p：：ced-1：：GFP+lin-15(+)]｝虫株(源自美国明尼苏达大学线虫遗传中心)，通过使用携带CED-1：：GFP融合蛋白的MD701转基因线虫可以直接在荧光显微镜下观察到凋亡细胞[10]。线虫均在20℃恒温环境培养。

1.2 主要试剂与仪器

DEHP(中国上海百灵威科技公司)；二脒基苯基吲哚(DAPI)，购于美国Sigma-Aldrich公司。Olympus SZ61体视显微镜、Olympus BX41生物荧光显微镜(日本Olympus公司)。K溶液[11]和M9缓冲液[12]按参考文献配制。

1.3 实验方法

1.3.1 染毒剂的配制 取DEHP液100 mg于1 mL的0.5%二甲基亚砜(DMSO)水溶液中，配成100 mg/mL的储备液，用无菌K溶液稀释成所需的染毒浓度，根据50%致死浓度(LC50)设定3个染毒剂量组，分别为0.1、1.0、10.0 mg/L，同时设置K溶液对照组。

1.3.2 染毒方法 选择L4期野生型秀丽线虫暴露染毒。染毒方式为固态培养基染毒法，使染毒液均匀的分布在6孔板内。随后将L4期线虫置于6孔板内，每孔最少20条线虫，20℃下恒温培养染毒48 h。

1.3.3 后代数目和世代时间的测定[13]染毒结束后，将线虫挑到NGM培养基上。每隔36 h转移至新的NGM培养基上，直到停止产卵为止，计数每条秀丽线虫产生的后代数目。每个剂量组挑取20条线虫，实验重复3次。世代时间：观察并记录秀丽线虫产第一枚卵的时间，记为T1。随后，观察该卵成长为成虫后，其产出的第一枚卵的时间，记为T2，T2与T1之间的时间间隔即为线虫的世代时间。

1.3.4 瞬时产卵量 将染毒结束的线虫挑到新的NGM培养基中，4 h后计数NGM培养基中的受精卵数目。瞬时产卵量=总的受精卵数目/4。

1.3.5 生殖细胞数 染毒结束后挑取秀丽线虫至载玻片上，避光加入2μg/mL的DAPI染液，在荧光显微镜下拍照。通过新月型细胞核来辨别有丝分裂区和减数分裂区，一列细胞中有2个或2个以上的新月型细胞核的区域为过渡区(TZ)[7]，排列在顶体末梢细胞与TZ之间的细胞为有丝分裂区细胞，TZ之后的细胞为减数分裂区细胞。

1.3.6 粗线期细胞凋亡 利用转基因虫株或AO染色进行活体荧光标记都可以用来观察粗线期生殖细胞的凋亡情况，但是利用转基因虫株可以不经过染色的程序直接在显微镜下进行观察。MD701转基因虫株，携带CED-1：：GFP，其可以识别凋亡细胞并聚集到凋亡细胞周围，使凋亡细胞呈现亮绿色的圆形纽扣状[14]，本实验利用MD701转基因虫株观察粗线期生殖细胞凋亡。将染毒后的MD701虫株用M9溶液清洗干净后置于2%琼脂凝胶上，滴加0.025 mmol/L盐酸左旋咪唑20μL麻醉线虫，在荧光显微镜下观察凋亡情况。计数线虫单侧性腺臂中凋亡细胞的数目。

1.4 统计分析

利用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，结果采用xˉ±s表示，后代数目、世代时间、生殖细胞数、细胞凋亡数采用单因素方差分析，不同剂量组与对照组之间的比较采用Dunnet’s t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DEHP对秀丽线虫生殖能力的影响

结果见图1，与对照组相比，当DEHP的浓度为1.0和10.0 mg/L时，秀丽线虫的后代数目和瞬时产卵量均下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，而各剂量组秀丽线虫的世代时间差异不明显(P均＞0.05)。

图1 DEHP染毒对秀丽线虫生殖能力的影响

2.2 DEHP对秀丽线虫生殖细胞数目的影响

结果见图2。当DEHP的染毒浓度为0.1、1.0、10.0 mg/L时，线虫的总生殖细胞数减少，与对照组相比差异有统计学意义(P均＜0.05)，且随着染毒剂量的增加，生殖细胞数逐渐减少(P＜0.01)。与对照组相比，有丝分裂区的细胞数在1.0和10.0 mg/L染毒组出现明显下降(P均＜0.01)，减数分裂区的细胞数在0.1～10 mg/L染毒组均出现明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。

图2 DEHP染毒对生殖细胞数目的影响

2.3 DEHP对线虫粗线期凋亡的影响

结果见图3，与对照组相比，在0.1 mg/L的DEHP暴露下，粗线期生殖细胞的凋亡数差异无统计学意义(P＞0.05)。当DEHP染毒剂量为1.0和10.0 mg/L时，粗线期生殖细胞的凋亡数显著增多，差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。

图3 DEHP染毒后，秀丽线虫MD701突变株粗线期细胞的凋亡情况

3 讨论

有研究表明，DEHP影响卵泡的发育导致成熟卵泡减少，闭锁卵泡增多，从而导致生殖能力的下降，生殖器官畸形等[15]。DEHP可以通过扰乱卵泡的生长发育和成熟以及抑制排卵，导致卵母细胞的凋亡来发挥其生殖毒性，破坏卵巢功能，影响生殖能力[16-17]。但有关其影响卵子的发生以及相关雌性生殖毒性机制的研究较少。秀丽线虫已成为一种较为成熟的模式生物，其生殖细胞在性腺中的位置固定，利用荧光染料在显微镜下易于区分和观察，在生殖毒性的研究中具有一定的优势[18]。

本试验中，我们首先探讨了DEHP染毒后对秀丽线虫后代数目、世代时间和瞬时产卵量等基本生殖指标的影响。实验结果表明，1.0和10.0 mg/L剂量下DEHP可以导致秀丽线虫后代数目和瞬时产卵量的减少，但对世代时间无明显影响。性腺生殖细胞数是评价外源化学物生殖毒性的重要指标之一[19]。结果表明，在1.0和10.0 mg/L DEHP暴露后会导致秀丽线虫总的生殖细胞数显著下降，这一结果与前期的实验结果一致[20]，基于这一实验结果，我们认为DEHP暴露后导致秀丽线虫后代数目、瞬时产卵量等生殖能力的下降可能与总生殖细胞数的减少有关。进一步研究发现，经1.0和10.0 mg/L剂量DEHP暴露后，秀丽线虫有丝分裂区和减数分裂区的细胞数也相继减少。由此提示，DEHP不仅影响了卵子发生过程中有丝分裂区的增殖能力导致细胞增殖阻滞，而且对减数分裂区生殖细胞的分化能力也产生了影响。

在正常的生理情况下，秀丽线虫粗线期生殖细胞会发生生理性的细胞凋亡，当受到外界刺激时，细胞的凋亡数目会增加[21]。我们利用秀丽线虫突变株MD701来观察生殖细胞的凋亡情况，结果发现，随着DEHP染毒剂量的升高，粗线期凋亡的细胞数目逐渐增多。目前有研究表明，DEHP会导致细胞凋亡增加，因此，我们认为DEHP暴露会导致秀丽线虫粗线期凋亡数目增多，从而导致减数分裂区的细胞数目下降。

综上所述，DEHP暴露可以导致秀丽线虫有丝分裂区增殖阻滞和减数分裂区细胞数目减少，并伴随粗线期细胞凋亡增加。这一结果提示DEHP可以通过诱导粗线期凋亡数增多进而减少有丝分裂区和减数分裂区细胞数，从而导致后代数目下降，这可能是DEHP影响雌性生殖毒性的机制之一。