百草枯对大鼠血脑屏障及认知记忆功能的影响

马 慧，李紫乔，赵 丽，孙 艳*

(哈尔滨医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081)

百草枯(paraquat，PQ)，又称克无踪，分子式为C12H14N2C12，是有机杂环类接触性除草剂，因其对农作物损害较小，除草效果好，在世界各国广泛使用[1]。PQ经皮肤接触、呼吸道和消化道进入人体，造成急性中毒，至今尚无特效解毒剂[2]。我国作为发展中的农业大国，PQ消费量在2001—2011年间由1 560 t增至9 080 t，位居世界第一，虽然国家已颁布法令，于2014年7月之后不允许再生产和使用水剂，但PQ母药的生产仍未予禁止。考虑到世界各国已生产和使用PQ带来的环境和健康风险需要很长一段的时间来消化，加之目前仍无治疗PQ中毒的有效方法和解毒剂，有研究者预测，在未来较长的一段时间，PQ仍将是全球环境与健康领域的重要风险因子[3]。PQ极易溶于水，在酸性和中性溶液中稳定存在，但在碱性溶液中容易分解。PQ通过职业、食物和饮用水等慢性低剂量暴露作用于人群，增加帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等中枢神经系统退行性疾病的发病风险[3]。使用PQ的人群比未使用过PQ的人群发生PD的危险性显著增加，且接触时间越长发病的危险性越高[4]。动物实验表明PQ能引起多巴胺(dopamine，DA)能神经元减少、α-共核蛋白(α-Syn)聚集、路易小体(Lewy body，LB)形成及动物运动行为异常等类似于PD的症状[5-6]。细胞实验表明，在肺上皮细胞中PQ引起活性氧的生成增加，且线粒体膜电位明显下降，线粒体毒性明显大于活性氧所致的氧化损伤[7]。近来有学者认为，PQ诱导中枢神经系统退行性变的前提是增加了血脑屏障的通透性，通过血脑屏障，在大脑不同区域(额叶皮质、纹状体、海马、小脑)积聚，作用于特定靶细胞，导致各种功能性紊乱[8]。故本文在前人研究高剂量PQ的基础上，采用动物实验，以低剂量PQ作为受试物，探究低剂量亚慢性接触PQ对大鼠血脑屏障及认知、学习、记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康SPF级SD雄性大鼠45只，体质量180～200 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司(CHLJ2018031514)。将大鼠安置在动物屏障系统[SYXK(黑)2017-008]内，给予12 h/12 h明暗交替，室内温度在18～20℃之间。适应性饲养1周后，将大鼠随机分成3组即对照组(生理盐水)、PQ染毒低剂量组(1 mg/kg)和高剂量组(10 mg/kg)，每组15只。腹腔注射染毒6周，每周2次，每周观察1次体质量变化。实验结束后每组随机抽取5只大鼠进行伊文思蓝(Evans blue，EB)渗透实验，各组剩余的10只大鼠进行行为学实验。

1.2 试剂与仪器

百草枯纯度98%，购自上海梯希爱化成工业发展有限公司；伊文思蓝和甲酰胺购自大连美仑生物技术有限公司；Morris水迷宫实验视频分析系统、SDT-8跳台视频分析系统和STT-100穿梭实验系统均购自成都泰盟公司。

1.3 伊文思蓝渗透实验

用伊文思蓝浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL的甲酰胺溶液制作伊文思蓝标准曲线。每组取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉，经左侧股静脉缓慢注入2 mL/kg伊文思蓝，体循环1 h，断头取脑。将脑组织置于甲酰胺(10 mL/g)中，匀浆后60℃水浴24 h，12 000 r离心30 min，取上清，用紫外分光光度计检测吸光度D(632)值，计算脑中伊文思蓝含量，标准曲线为y=A x+B，则

1.4 Morris水迷宫实验

在黑色圆形水池(直径100 cm)中蓄水至水面高度约为45 cm，水温维持在20～22℃之间。水池分为4个象限，在水下约2～2.5 cm处放置一个圆形透明平台。取每组10只大鼠，实验分为两个阶段，即训练阶段和测试阶段，训练阶段：每日同一时间将大鼠面朝水池壁从4个象限依次入水，限时90 s，若90 s内大鼠找到平台，则记录其逃避潜伏时间及运动轨迹，若90 s内未找到平台，则引导其找到平台，并停留10 s，加深记忆，连续训练4 d。测试阶段：撤掉平台后，限时90 s，记录大鼠穿越原平台位置的次数。

1.5 跳台实验

箱体底部栏杆可通电，角落处放置绝缘性平台，每组10只大鼠实验前放入箱体中，适应环境3 min，实验开始后，底部栏杆通电，电压在0～30 V之间波动，记录5 min内大鼠第1次跳上平台后滞留的时间(即记忆潜伏期)和跳下平台的次数(即错误次数)。

1.6 穿梭箱实验

箱体底部为可通电栏杆，中间以一个含可穿梭洞的黑色塑料板分隔成等大的两室，每组10只大鼠，实验开始前，将大鼠放入一室中适应5 min，实验开始后，给予大鼠光照10 s，若大鼠穿越至另一室，记为条件反应1次，若大鼠10 s内未穿越，给予10 s电刺激(电压36 V)，大鼠逃避电击穿越至无电击室，记为非条件反应1次，10 s电刺激后仍未穿越，记为错误反应1次。每只大鼠每天完成1次，间隔20 s，重复循环20次，连续6 d，记录第6天每只鼠条件反应次数和错误反应次数。

1.7 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计分析，Morris水迷宫中，对重复测量的逃避潜伏期采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，其余数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用Bonferroni法，所有数据表示为xˉ±s，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 伊文思蓝实验结果

脑组织大体图片显示，与对照组相比，1和10 mg/kg PQ组蓝染明显较深(图1)。检测结果显示，2个PQ剂量组大鼠脑组织的伊文思蓝含量较对照组显著升高，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)，见图2。

图1 各组大鼠脑组织伊文思蓝大体图

图2 各组大鼠脑组织中伊文思蓝含量

2.2 Morris水迷宫实验结果

1和10 mg/kg PQ染毒剂量组大鼠的运动轨迹比对照组复杂(图3A)，对大鼠训练期间逃避潜伏期进行重复测量的方差分析得出，不同剂量PQ引起大鼠逃避潜伏期的差别有统计学意义(P＜0.05)，不同训练天数大鼠逃避潜伏期的差别有统计学意义(P＜0.05)，各组逃避潜伏期均下降。PQ剂量组与训练天数之间存在交互关系(P＜0.05)，见表1。逃避潜伏期在不同剂量PQ诱导下，各训练天数的变化趋势不同，随着训练天数的增加，各组逃避潜伏期逐渐减少，且10 mg/kg PQ组下降的幅度明显低于对照组(图3B)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。测试阶段，1和10 mg/kg PQ组穿越原平台位置次数均低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3C。

表1 水迷宫训练阶段各组逃避潜伏期方差分析表

图3 Morris水迷宫实验结果

2.3 跳台实验结果

与对照组相比，1和10 mg/kg PQ组大鼠记忆潜伏期均降低(图4A)，错误次数均增加(图4B)，10 mg/kg PQ组错误次数高于1 mg/kg PQ组错误次数，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图4 跳台实验结果

2.4 穿梭箱实验结果

第6天训练结果，1和10 mg/kg PQ组大鼠条件反应次数明显低于对照组(图5A)，错误次数明显高于对照组(图5B)，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)。

3 讨论

图5穿梭箱实验结果

PQ在肺、肝、肾、心脏中的急、慢性损伤作用已有大量研究[9]，研究者逐渐开始关注PQ对脑的影响。有研究[10]表示10 mg/kg的PQ可增加血脑屏障通透性，诱导帕金森病，而在PQ中毒幸存者的血液中检测到PQ的最高浓度为4.8μg/mL，以成年男性体质量76 kg，血容量5 000 mL为例，约0.3 mg/kg就能导致人体中毒。这个剂量相当于1/13 LD50(PQ对人群的LD50为4 mg/kg)。PQ对小鼠的LD50为130 mg/kg，10 mg/kg是可以直接引起人类中毒的[11]。但是，在PQ大量使用地区的居民和农药喷洒者是低剂量长期接触，所以本实验针对低剂量PQ(1 mg/kg)进行研究，选用生理盐水及经典高剂量PQ(10 mg/kg)进行对比。有研究表明，短暂一次性接触PQ的新生儿，血脑屏障受损，进入脑中的PQ明显增加[12]。血脑屏障由脑血管内皮细胞、血管基底膜和神经胶质细胞组成，是血浆与脑细胞之间的屏障，具有稳定中枢神经系统的作用。血脑屏障利用血管内皮细胞限制血管内极性物质的被动扩散。PQ通过胆碱摄取系统进入脑微血管内皮细胞。PQ能够通过血脑屏障影响DA的合成、储存、转运和降解等环节破坏DA递质的稳态，引发神经元凋亡，从而导致类PD症[13]。在人群研究中，百草枯暴露与PD之间具有明确相关性[14]。

本文针对低剂量PQ对血脑屏障的影响进行实验，发现1 mg/kg PQ能够损伤血脑屏障，增加血脑屏障渗透性，进入脑中的PQ增加，从而损伤认知、学习、记忆功能。使得大鼠认知、学习、记忆功能下降。低剂量组(1 mg/kg)与高剂量组(10 mg/kg)间差异无统计学意义，由此可见低剂量PQ的影响不容小觑，低剂量接触也能够增加血脑屏障通透性，使PQ进入脑中作用于不同区域的脑组织，进而降低认知、学习和记忆能力。此结论为进一步研究PQ损伤血脑屏障的机制奠定了基础，为PQ影响人类健康的预防工作提供了科学依据。