原花青素对Aβ25-35介导的tau蛋白过度磷酸化及p38 M APK信号通路的影响

王 旭，张小强，*，刘 静，陈姚姚，卢晓星，苗歆雨

(1．东南大学公共卫生学院，江苏 南京

210009；2．东南大学环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009）

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病[1]。AD的主要病理特征包括老年斑和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，过度磷酸化的tau蛋白与微管蛋白的结合能力降低，进而在细胞内相互聚集成双螺旋样纤维(PHFs)，导致NFTs的形成[2]。虽然由β淀粉样前体蛋白水解而来的β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性曾被认为在AD发展中起主要作用，但近来越来越多的证据却表明过度磷酸化的tau蛋白在AD等神经退行性疾病中发挥着关键作用[3]。氧化应激是AD的一个重要发病机制，Aβ的产生和聚集与其关系紧密。Aβ通过多条途径诱导活性氧的产生，并可作用于多靶点加剧氧化应激，从而导致线粒体损失，进一步引起tau蛋白的高度磷酸化，导致神经元结构改变，最终造成AD的发病[4-5]。而由于磷酸酯酶和蛋白激酶活性的失调，使正常的tau蛋白丧失与微管结合能力造成微管不稳定，进一步导致神经元功能障碍，神经变性至最终的功能缺陷[6]。其中丝裂原活化蛋白激酶(miotgenactivated protein kinase，MAPK)是tau蛋白过度磷酸化的关键性激酶，其中p38 MAPK (p38 miotgenactiveted protein kinase)是其中的重要组成部分。研究显示激活p38 MAPK可引起神经系统tau蛋白的过度磷酸化[7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是一种生物学功能广泛的多酚类化合物，具有极强的抗氧化活性。目前已有一些研究发现PC可有效改善AD大鼠海马组织中由Aβ沉积所导致的神经损伤，但国内外学者在PC对tau蛋白过度磷酸化的作用及其作用机制方面的关注相对较少[8-9]。本实验利用β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)诱导SH-SY5Y细胞构建模型，使用原花青素进行干预并探讨其对tau蛋白过度磷酸化及p38 MAPK信号通路的影响，以期更好地明确其生物学作用。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂

原花青素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Aβ25-35、四甲基噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT)、 二 甲 基 亚 砜 (dimethylsulphoxide，DMSO)均购自Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12培养基购买于Thermo Fisher公司；胎牛血清购于Clark Bio公司；人成神经母细胞瘤SHSY5Y细胞购于中国典型培养物保藏中心；Bradford蛋白含量检测试剂盒购于江苏凯基生物科技发展有限公司；微量丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Tau、p-Tau(Ser396)、p38、p-p38、SB203580阻断剂及actin一抗和二抗、Western blot化学发光试剂盒均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 主要仪器

Series 8000恒温培养箱，购于Thermo Scientific公司；IX51倒置显微镜购自Olympus公司；5417R高速冷冻离心机购自Eppendorf AG公司；RT-6000酶标分析仪购自Rayto公司；Sonicator 4000超声破碎仪，购于Misonix Inc公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养 将人成神经母细胞瘤细胞SHSY5Y培养于DMEM/F12完全培养基中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素与100 mg/mL链霉素)，置于CO2体积分数为5%的37℃恒温培养箱中孵育，每2 d换液1次，每周传代1次。

1.3.2 药物配制 将20 mg原花青素溶于20 mL培养液中，制成终浓度为1 mg/mL的母液，分装后置于-20℃保存。将冷冻干燥的1 mg Aβ25-35溶于965μL纯水，制成1 mmol/L的母液，分装，37℃恒温箱孵育7 d，形成凝聚态后于-20℃保存；临用前，将药物稀释至所需浓度。

1.3.3 MTT法检测细胞存活率 细胞以5×104个/mL的浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，待细胞贴壁后进行分组，每组设5个复孔。在检测原花青素对SH-SY5Y细胞存活率的影响时，分为调零组、对照组、不同浓度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素干预组；在检测Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活率的影响时，分为调零组、Aβ25-35对照组、不同浓度(0.1、1.0、2.5、10.0、20.0μmol/L)Aβ25-35染毒组；在检测原花青素干预对Aβ25-35染毒的SH-SY5Y细胞存活率的影响时，分为调零组、对照组、1.0μmol/L Aβ25-35染毒组、不同浓度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35处理组。调零组不含细胞，对照组细胞正常培养，处理组加入原花青素或和Aβ25-35后稀释至指定浓度，继续培养24 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液10μL，37℃孵育4 h后，吸弃培养基，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪测定吸光度D(496)值，计算各组细胞存活率。

细胞存活率/%=[D(496)实验组-D(496)调零组]/[D(496)对照组-D(496)调零组]×100%

1.3.4 硫代巴比妥法检测细胞内MDA含量 将SHSY5Y细胞以6×105个/mL的浓度接种于60 mm培养皿中，每皿1 mL，待细胞贴壁后，设对照组，1.0 μmol/L Aβ25-35染毒组，不同浓度(0.1、1.0、2.5和5.0 μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35干预组。继续孵育24 h后，以预冷PBS收集细胞，至冰水混合物中，超声波匀浆共30 s细胞破碎，按试剂盒说明书检测并计算各组样本中MDA浓度。

MDA 浓度/(nmol/mg)=[D(532)测定值-D(532)对照值]/[D(532)标准值-D(532)空白值]×标准品浓度/待测样本蛋白浓度

1.3.5 WST-8法检测细胞内总SOD活力 细胞培养、分组及提取同1.3.4，分别在待测样品和空白对照组中加入相应的WST工作液和酶工作液，于37℃中孵育20 min，并计算各组样本的SOD抑制率及SOD活力。

1.3.6 Western blot检测p-tau、tau、p38、p-p38蛋白表达水平 SH-SY5Y细胞以6×105个/mL的浓度接种于60 mm培养皿中，分组同1.3.4。收集细胞，用RIPA裂解液提取蛋白，高速离心机4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白进行定量。将蛋白进行凝胶电泳分离、转膜、封闭、p-tau、tau、p38、p-p38一抗4℃孵育过夜，洗膜后二抗m-IgGκBP-HRP和山羊抗兔IgG-HRP孵育2 h，再次洗膜，最后加Western blot化学发光剂显影，并用Image J软件对灰度值结果进行分析。使用同样的方法分别检测对照组、Aβ25-35染毒组、SB203580组、Aβ25-35+SB203580组、Aβ25-35+5.0 μg/mL原花青素干预组的p-tau、tau、p38、p-p38的蛋白表达情况。

1.4 统计学方法

实验结果以xˉ±s表示，应用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，方差齐时采用LSD-t检验，不齐时采用Dunnett-T3检验，以α=0.05为检验水准。线性相关分析结果用相关系数r表示。

2 结果

2.1 不同浓度的原花青素对细胞存活率的影响

MTT实验结果如图1，与对照组相比，0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素单独作用下，对SH-SY5Y细胞存活率的影响差异均无统计学意义(P＞0.05)。该结果表明本实验所用剂量范围内，原花青素对SH-SY5Y细胞无明显毒性作用。

图1 原花青素对SH-SY5Y细胞存活率的影响

2.2 不同浓度Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活率的影响

MTT实验结果如图2。与对照组相比，不同浓度Aβ25-35均使SH-SY5Y细胞活力降低(P＜0.05)。后续实验选择1.0μmol/L Aβ25-35染毒细胞建立细胞损伤模型。

图2 不同浓度Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活率的影响

2.3 原花青素干预对Aβ25-35染毒SH-SY5Y细胞存活率的影响

MTT实验结果如图3。与染毒组(1.0μmol/L Aβ25-35)相比，原花青素干预24 h后，细胞存活率呈不同程度升高，其中0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素干预组与Aβ25-35组及对照组间的差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。

图3 原花青素对Aβ25-35染毒细胞存活率的影响

2.4 原花青素对Aβ25-35染毒SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响

原花青素对Aβ25-35染毒细胞MDA和SOD水平的影响如表1所示，可见，与对照组相比，1.0μmol/L的Aβ25-35使细胞内MDA含量明显增高，而细胞SOD活力明显降低。随着原花青素浓度的升高，MDA水平呈现不同程度的下降，而SOD水平则呈不同程度升高。其中，1.0、2.5、5.0μg/mL的原花青素促进细胞SOD活力增强(P＜0.05)，5.0μg/mL的原花青素使细胞MDA生成减少(P＜0.01)，而5.0μg/mL的原花青素可逆转Aβ25-35诱导改变的MDA水平，与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1不同浓度原花青素对Aβ25-35染毒细胞中MDA浓度和SOD活力的影响

2.5 原花青素对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响

Western blot法检测结果如图4所示。与对照组比较，给予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y细胞ptau蛋白表达升高，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。与1.0 μmol/L Aβ25-35组相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)预处理SH-SY5Y细胞，p-tau(Ser396)蛋白表达下调(P＜0.05)，且磷酸化水平呈剂量依赖性降低(r=0.755，P＜0.05)。

图4 原花青素对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响

2.6 原花青素对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞p38蛋白磷酸化的影响

Western blot法检测原花青素对Aβ25-35染毒细胞p38 MAPK通路的影响结果如图5所示。与对照组比较，给予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y细胞pp38蛋白表达升高(P＜0.05)。与1.0 μmol/L Aβ25-35组相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)预处理SH-SY5Y细胞，p-p38蛋白表达下调(P＜0.05)，且磷酸化水平呈剂量依赖性降低(r=0.768，P＜0.05)。

2.7 原花青素通过p38 MAPK通路抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化

应用SB203580阻断剂对p38、tau蛋白及其磷酸化水平影响的结果如图6所示。与对照组相比，单独应用阻断剂组并未改变p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表达水平(P＞0.05)。Aβ25-35诱导组可显著上调 p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表达(P＜0.05)。与 Aβ25-35染毒组比较，Aβ25-35+SB203580组的p-p38、p-tau(Ser396)蛋白水平明显下调，Aβ25-35+5.0μg/mL原花青素干预组的p-p38、p-tau(Ser396)水平也明显下降(P＜0.05)。

图5 原花青素对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞p38蛋白磷酸化的影响

图6 p38在原花青素抑制Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的作用

3 讨论

Tau蛋白是一种可溶性微管相关蛋白，在促进微管组装和维护微管稳定方面发挥重要作用，在神经元中表达，其主要定位于轴突。微管蛋白装配成微管后，tau蛋白与原纤维丝保持垂直的状态结合，减少微管的弹性，增加微管的稳定性[10]。然而，在AD患者中观察到tau蛋白磷酸化水平的过度升高，使其与微管的结合能力降低，从而互相聚集形成具有神经毒性的神经元纤维缠结，进而通过异常复杂的机制诱发神经元变形最终引发老年痴呆[11]。在Aβ刺激下，过度磷酸化的tau蛋白在成对螺旋丝上急剧增加，进一步导致细胞骨架失稳和记忆功能障碍[12]。研究发现，Aβ刺激tau蛋白过度磷酸化的机制与Aβ引发氧化应激效应相关[13-14]。Aβ的神经毒性由氧自由基和氧自由基清除剂来介导和调节，过度聚合的Aβ损害神经细胞，并促使氧自由基生成增加，而抗氧化物质SOD水平下降，MDA水平上升，SOD是重要的氧自由基清除剂之一。

本研究显示首先利用Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞建立体外AD模型，给予原花青素干预来检测氧化应激水平，结果显示原花青素可明显升高抗氧化物质SOD的水平，且降低MDA的水平。氧化应激所导致的RCAN1酶水平增加，这种钙调磷酸酶调节蛋白会促使Tau蛋白磷酸化。

本研究显示原花青素可通过抑制Ser396位点tau蛋白的过度磷酸化来保护SH-SY5Y细胞免于Aβ介导的神经毒性。据相关研究发现，tau蛋白在Ser396位点处的过度磷酸化可引起成对螺旋丝状AD样聚集体和微管细胞骨架的不稳定，并会诱导凋亡细胞的死亡和区域特异性神经变性[15]。因此，原花青素对该位点tau蛋白过度磷酸化的抑制可能与其发挥对神经的保护作用有关。

Tau蛋白发生过度磷酸化主要由体内蛋白激酶引起，其中丝裂原活化蛋白激酶(miotgen-activated protein kinase，MAPK)作为一种脯氨酸蛋白激酶发挥着重要作用。体外试验中证实，在Aβ处理后的神经元中，MAPK被激活，并引起tau蛋白过度磷酸化。p38是MAPK途径的重要组成部分之一，本研究结果表明原花青素可抑制Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞p-p38蛋白表达水平，为了确认原花青素是否可通过p38 MAPK信号通路发挥抑制tau蛋白磷酸化作用，我们选择p38 MAPK通路的特异性抑制剂SB203580进一步研究p38 MAPK信号通路在原花青素抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化中的作用。SB203580是广泛应用于p38信号通路的阻断剂。研究显示p38阻断剂的应用可显著改善Aβ25-35介导的细胞神经毒性[16-17]，Aβ可激活p38 MAPK引起神经系统中tau蛋白的过度磷酸化[18]，那么是否可抑制p38 MAPK通路激活从而改善Aβ25-35介导的SH-SY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化。为此，我们进一步做了相关研究，发现单独抑制剂组tau蛋白磷酸化水平无明显改变，原花青素与p38阻断剂应用组均可引起tau蛋白磷酸化水平的下调，且降低程度无明显差异，所以p38 MAPK活性的调节可能对原花青素减轻Aβ诱导的tau蛋白过度磷酸化发挥着重要的调控作用。

本研究证实了原花青素对Aβ25-35介导的tau蛋白过度磷酸化来发挥神经保护作用，其可能是通过抑制p38 MAPK信号传导途径来实现，该结果提高了我们对原花青素具有神经保护作用的认知，为进一步研究老年神经退行性疾病的防治也提供了新思路。