分枝杆菌LY-1转化植物甾醇产9α羟基雄烯二酮的发酵工艺优化

王向栋，李 会，陈志蔚,蔡兆培,史劲松，许正宏

(1. 江南大学药学院，江苏无锡214122；2. 大丰市佳丰油脂有限责任公司，江苏盐城224100; 3.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122)

甾体药物是世界上仅次于抗生素的第二大类药物[1-2]，对机体的生命活动起着非常重要的调节作用，例如糖皮质激素是临床应用最为广泛的抗炎药物[3]。9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一类重要的甾体药物中间体，因其独特的9位羟基，可利用化学方法引入一个卤族原子，同时在C11β-位上形成重要的功能羟基，由此衍生的卤代类甾体药物的抗炎、抗敏效果更加明显，药效时间也更为持久[4]。依靠微生物强大及复杂的酶催化体系特异制备甾体药物中间体，可有效简化工艺路线、提高催化选择性和整体的收率[5-6]。因此，9α-OH-AD的微生物合成越来越受到关注[7-8]。

在甾体的微生物转化过程中，培养基中的各种组分以及培养条件对菌株的生长以及胞内酶系的表达都具有很大的影响[9-10]，因此，发酵工艺优化是有效提高9α-OH-AD产量的途径之一[11]。通过单因素实验考察培养基各组分对菌体转化的影响，是目前常用的培养基组分优化方式[12]。然而单因素实验往往无法综合考虑各因素之间的相互作用，因此尝试通过正交试验快速有效地确定各组分的最优条件。正交试验是研究多因素多水平的一种方法，近年来采用正交试验对发酵培养基进行优化已取得了较好的结果[13-14]。

课题组在前期获得1株分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1，能转化植物甾醇制备9α-OH-AD，具有较强的羟化能力。在前期研究中，改进了底物投料方式，目的产物9α-OH-AD的产量有明显提升[15]。然而9α-OH-AD的产物得率仍存在一定的不足，本研究中，笔者以分枝杆菌LY-1作为出发菌株，通过单因素实验确定最适培养基的各个成分，并在此基础上，进行正交试验优化，进一步提高目的产物9α-OH-AD的得率，为后续的分子改造奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

分枝杆菌LY-1保存在江南大学微生物制药与系统发酵研究室。植物甾醇(β-谷甾醇47.0%，菜油甾醇24.6%，豆甾醇15.5%，菜籽甾醇3.4%)，湖北巨胜科技有限公司；9α-OH-AD(纯度大于98.0%)，上海瀚香生物科技有限公司；金龙鱼牌大豆油、玉米浆，安徽华恒生物科技股份公司；酵母粉，美国Oxoid公司；其他常规试剂均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 培养基

PDA固体培养基(g/L)：马铃薯 200、葡萄糖 20、琼脂 20。

种子培养基(g/L)：NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6。

斜面培养基(g/L)：NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6、琼脂 2.0。

发酵培养基(g/L)：NaNO35.4、玉米浆20、(NH4)2HPO40.6、植物甾醇15；pH 8.0。

1.3 方法

1.3.1 分枝杆菌LY-1的培养及转化

挑取单菌落接种于50 mL种子培养基中(250 mL摇瓶)。在往复式恒温摇床(30 ℃、120 r/min)中培养2～3 d，转接至100 mL发酵培养基(500 mL摇瓶)中，接种量为1%(体积分数)，置于摇床上，发酵周期为7 d，培养条件为30 ℃、120 r/min。

1.3.2 分枝杆菌LY-1培养基组成的优化

1)碳源优化。分别选取可能有利于目的产物积累的糖类物质，包括糖蜜、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油，代替原发酵培养基中的碳源，以玉米浆作对照，同时保持培养基中的含碳水平不变(含碳水平为2%的玉米浆)，按照1.3.1节中的方法进行发酵转化，转化结束后用高效液相色谱(HPLC)测定产量。

2)氮源优化。分别用不同的氮源((NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl、牛肉膏)代替原发酵培养基中的氮源，以NaNO3作对照，保持发酵培养基中含氮水平不变(含氮水平为0.54%的NaNO3)。

3)磷酸盐优化。分别用不同的磷酸盐(NH4H2PO4、KH2PO4、K2HPO4和NaH2PO4)代替原发酵培养基中的磷酸盐，以(NH4)2HPO4作对照，保持发酵培养基中的含氮量不变(含氮水平为0.06%的(NH4)2HPO4)。

4)金属离子优化。分别选用ZnSO4、MgSO4、FeSO4、FeCl3、NiCl2、CuSO4、CaCl2和MnCl2等金属盐化合物，考察其对菌体转化的影响。

1.3.3 培养基组成的正交试验设计

通过上述发酵培养基组成优化的单因素实验结果，分别选取最佳组分为考察对象，设计5因素4水平的正交试验，以此来确定最佳培养基组成。

1.3.4 培养基条件的优化

1)pH优化。已知pH在7.5～8.5，更适合分枝杆菌转化植物甾醇积累9α-OH-AD，因此选取了pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0这6个点进行pH优化。

2)接种量优化。原接种量为1%，因此选取了接种量为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%这6个点进行接种量优化。

3)温度优化。已知温度在28～30 ℃，更适合分枝杆菌转化植物甾醇积累9α-OH-AD，因此选取24、26、28、30和32 ℃这5个温度点进行优化。

1.3.5 转化产物的分析方法

1)分枝杆菌LY-1生物量的测定。在发酵过程中，取1 mL发酵液于无菌的2 mL EP管，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃上清。分别加入1 mL乙酸乙酯，1 000 r/min充分振荡15～30 min，在4 ℃下12 000 r/min离心10～15 min，弃上清。用乙酸乙酯洗2次，收集菌体，烘干至恒质量，称量。

2)产物萃取。在发酵过程中，每12 h取500 μL发酵液于无菌的EP管，加入500 μL乙酸乙酯，1 000 r/min充分振荡20～30 min。振荡结束后，静置分层，吸取上层乙酸乙酯于5 mL无菌EP管中。重复5次，将乙酸乙酯合并。室温下用氮吹仪将其浓缩，若产物浓度较大则出现白色结晶。在装有烘干产物的5 mL无菌EP管中，加入4 mL乙腈复溶后，HPLC检测。

3)利用HPLC法检测产物。以外标法进行产物定量，色谱柱规格为Agilent TC-C18、4.6 mm×250 mm、5 μm，流动相为乙腈和水(两者体积比为7∶ 3)，柱温为30 ℃，紫外检测波长为254 nm，流速为0.5 mL/min，进样量为10 μL。

产物浓度的计算见式(1)，产物得率的计算见式(2)。

ρ1=A1ρ0D/A0

(1)

Y1=ρ1M2/ρ2M1×100%

(2)

式中：ρ1为产物质量浓度(g/L)，ρ0为标准样品质量浓度(g/L)，ρ2为底物质量浓度(g/L)，A0为标样HPLC检测谱峰面积，A1为产物HPLC检测谱峰面积，Y1为产物摩尔得率，D为样品的稀释倍数，M1为产物摩尔质量，M2为底物摩尔质量。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基组成优化结果

分枝杆菌LY-1发酵培养基中仅含有玉米浆、NaNO3和(NH4)2HPO4，与已报道的培养基相比[16-17]，除碳源成分不明确外，还缺少金属离子等微量元素，因此尝试通过单因素优化确定最适组分。

2.1.1 碳源优化结果

碳源是微生物生长所需的一类营养物质，以玉米浆作为氮源，但同样含有少量成分可用作碳源[18]。而姜博等[19]发现玉米浆在培养基中作为碳源要优于葡萄糖。因此碳源优化时，对2种情况进行优化和比较，结果见图1。

由图1(a)可以看出：在不同碳源条件下，菌体的生物量都有不同程度提高，但目的产物9α-OH-AD的得率明显降低。当糖蜜替代玉米浆后，9α-OH-AD的得率仅达到24.2%，而其他碳源的产物得率基本都小于10%。可能的原因是糖蜜和玉米浆一样属于成分复杂的物质，其中还含有氨基酸、生物素等，因此当玉米浆被糖蜜替代后，对菌体转化的影响较少。而其他糖类替代后，由于培养基中成分单一，且没有其他一些营养成分，导致菌体转化能力下降。

图1 碳源对菌体转化和生长的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on trans- formation and growth of strain LY-1

由图1(b)可知：在玉米浆存在的情况下，添加其他碳源物质时，产物得率基本都有所下降，而生物量则有明显提高。如，添加葡萄糖后，产物得率最低，仅为18.5%，但生物量明显提高。同时发现副产物的积累增多，表明葡萄糖的添加虽然能提高菌体还原力[20]，但葡萄糖并不利于9α-OH-AD的积累。同时比较发现，添加可溶性淀粉后，产物得率有微弱提高，但考虑成本因素，1%的添加量相对于提高的程度，并不符合后期的应用；而添加麦芽糖和糖蜜后，两者的产物得率都明显降低。因此，选择最佳碳源为玉米浆。

2.1.2 氮源优化结果

氮源是构成微生物细胞中核酸和蛋白质的重要元素，主要分为无机氮源和有机氮源。分枝杆菌LY-1以NaNO3作为初始氮源，优化研究选用常见的几种氮源替代NaNO3，考察菌体转化的影响，结果如图2所示。

图2 氮源对菌体转化和生长的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources for transformation and growth of strain LY-1

从图2可以看出：不同氮源替换后，菌体生物量与对照相比无显著性差异。以KNO3作为氮源时，9α-OH-AD的得率最高，达到39.5%，表明微生物能够较快利用无机氮源；而蛋白胨和牛肉膏作氮源时，菌体转化效率较差，表明迟效性氮源不利于菌体利用，反而影响菌体的转化能力；以NH4Cl作为氮源时，产物得率最低，因为NH4Cl是生理酸性物质，当NH4+进入代谢后，不利于菌体转化的进行。因此，选择KNO3作为最适氮源用于后续研究。

2.1.3 磷酸盐优化结果

磷作为生物大分子的主要成分之一，对于菌体能荷状态的改变具有重要作用。培养基中的磷酸盐虽然含量较少，但微生物对不同的磷酸盐利用效果不尽相同，此外磷酸盐还会影响发酵转化过程中pH的调节，因此有必要对其进行优化，结果见图3。

图3 磷酸盐对菌体转化和生长的影响Fig.3 Effects of different phosphates for transformation and growth of strain LY-1

由图3可看出：添加NaH2PO4后菌体的转化效果最好，9α-OH-AD的产物得率为42.1%；而添加K2HPO4后，产物得率与对照相比无显著性差异。与氮源优化相似，K+的添加都有利于产物的积累，但添加KH2PO4和NH4H2PO4后，菌体的转化效率反而降低。因此，选择NaH2PO4作为最适磷酸盐。

2.1.4 金属离子优化结果

部分微量元素作为酶的辅基和激活剂，低浓度时对菌体生长和产物合成有促进作用，高浓度时反而出现抑制作用。考察添加不同金属离子对菌体生长和转化的影响，结果见图4。

由图4可知：当添加FeSO4、CaCl2和FeCl3时，与对照相比，产物得率都有一定程度提高。其中Fe2+具有电子传递的作用，因此添加到培养基中对菌体转化均有促进作用，Ca2+有利于提高侧链降解相关酶的活性。相反，添加Ni2+和Cu2+后，产物得率不足8%，表明其对菌体转化有明显的抑制作用。因此，选择CaCl2和FeSO4作为无机离子的添加，进行后续研究。

2.2 正交试验确定最适发酵培养基

通过单因素优化实验结果，选取玉米浆、KNO3、NaH2PO4、FeSO4和CaCl2为考察对象，设计5因素4水平的正交试验，以确定最适发酵培养基组成，正交试验设计及结果见表1，正交试验结果分析见表2。

图4 金属离子对菌体转化和生长的影响Fig.4 Effects of different metal ion for transformation and growth of strain LY-1

表1 L16(45)正交试验设计及结果

表2 L16(45) 正交试验分析表

由表2可知：5种因素对产物得率的影响程度从大到小依次为CaCl2、NaH2PO4、KNO3、玉米粉、FeSO4，最适发酵培养基组成为A2B1C4D3E1，即玉米浆30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.1 g/L。在此最适培养基条件下，植物甾醇投料质量浓度为15 g/L，摇瓶转化168 h，验证并重复3次，产物得率达到43.9%～44.9%。

2.3 发酵培养条件优化结果

2.3.1 接种量优化结果

在发酵过程中，接种量的多少会直接影响到菌体在培养基中生长繁殖的速度，因此，适当的接种量是菌体发酵过程中的关键因素。当接种量过小时，菌体初始浓度过低，导致菌体生长缓慢，发酵周期增长，在相同的发酵时间内产率较低；而当接种量过大时，会导致菌体过快生长，发酵液中的营养消耗过快和溶氧不足，菌体容易衰老和自溶，影响菌体的转化效率。考察接种量对发酵过程的影响，结果见图5。

图5 接种量对菌体转化的影响Fig.5 Effect of inoculum concentration on transformation of strain LY-1

由图5可以看出：当接种量较低时，菌体的转化效率较低；随着接种量的增加，产物得率也随之增加；当接种量为2%时，产物9α-OH-AD得率达到46.2%，相对于初始的接种量1%，有一定程度地提高；而接种量超过2%时，产物得率也随之降低，表明高的接种量并不利于目的产物的积累。由于目的产物的积累与菌体生长相耦联，因此，过高的接种量缩短了对数期，一定程度上也减少了菌体适应和转化的时间。

2.3.2 pH优化结果

在自然界中，微生物都有其最适的pH范围。通过调节培养基的初始pH，检测发酵结束时发酵液中9α-OH-AD的含量，结果如图6所示。

图6 pH对菌体转化和生长的影响Fig.6 Effects of pH on transformation and growth of strain LY-1

由图6可知：分枝杆菌的初始pH为7.5～8.5时，菌体的转化效果较好，这与文献[11,21]报道一致。同时，生物量变化趋势与产物积累相同，表明产物积累的差异是因为pH直接影响菌体的生长，从而间接影响产物得率。当初始pH为8.0时，菌体的产物得率最高。因此，确定最适起始pH为8.0。

2.3.3 温度优化结果

温度是影响菌体生长的重要因素，温度对培养基中的溶氧量、发酵过程中各个酶系的反应速率和目的产物的生成速率等有着重要的影响，还通过改变发酵液的物理性质来影响菌体生长和产物的合成。因此，研究温度对菌体转化过程的影响非常重要。考察温度对菌体转化的影响，结果见图7。

图7 温度对菌体转化的影响Fig.7 Effect of temperature on transformation of strain LY-1

由图7可以看出：随着温度的增加，转化效率也随之增加，当温度为30 ℃时，9α-OH-AD的得率最高，而温度超过30 ℃时，目的产物的得率迅速下降，因此确定30 ℃为最适转化温度。

综上，最终确定适宜的发酵条件为pH 8.0，接种量2%，温度30 ℃。在此条件下，产物得率达到46.2%～47.0%，比优化前的结果提高了约22.1%，9α-OH-AD的产量最高达到5.21 g/L,与初始转化工艺相比提高了22.1%，与目前国内外微生物转化植物甾醇生成9α-OH-AD的研究相比[7,9]，仍然处于较高水平。

近年来，国内外研究者通过解析3-甾酮-9α-羟基化酶[22-23]，采用分子改造手段提高9α-OH-AD产量，其中袁家代等[24]在分枝杆菌中异源表达3-甾酮-9α-羟基化酶基因，构建了产9α-OH-AD的菌株，但9α-OH-AD的含量仅为0.453 mg/L。王贵娥等[25]在分枝杆菌中强化表达了3-甾酮-9α-羟基化酶，9α-OH-AD的含量达到1.443 g/L，较出发菌提高了50.78%。

对该菌株产9α-OH-AD的机制研究正在进行之中，通过代谢工程等手段进一步提高菌株LY-1生产9α-OH-AD的能力是后续工作的研究方向。

3 结论

对培养基各成分进行单因素实验优化，最终确定分枝杆菌LY-1转化植物甾醇生成9α-OH-AD的最适培养基各组分。在此基础上，对选择的各组分进行正交试验优化，最终确定最适培养基为玉米浆30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.10 g/L；而后，再次通过单因素实验优化培养条件，最终确定适宜的培养条件为pH 8.0，接种量为2%，温度为30 ℃，在此条件下，9α-OH-AD的得率可达46.2%～47.0%。