盐单胞菌S62 β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的研究

朱五二，缪明永，顾正华，李由然，丁重阳，石贵阳

(1. 江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122； 2. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122； 3. 第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海200433)

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)俗称乳糖酶(lactase)，属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，可以水解β-1,4-糖苷键，同时还具有半乳糖苷转移酶活性[1]，用于功能性食品低聚半乳糖(GOS)的合成。β-半乳糖苷酶广泛存在于微生物(细菌、真菌和酵母)、植物(尤其是杏仁、桃、杏和苹果)和动物器官中[2-4]。微生物酶具有较高的生产力，能降低生产成本。目前已有古细菌、细菌、真菌和酵母的β-半乳糖苷酶研究报道[5]，从真菌(米曲霉和黑曲霉)和酵母(乳酸克鲁维酵母和脆弱克鲁维酵母)获得的酶显示出巨大的商业潜力，来自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶是使用最广泛的酶之一[6-9]。

低聚半乳糖是以乳糖作为供体和受体底物，利用β-半乳糖苷酶的转糖基化活性产生的具有高达9聚合度(DP)的寡糖混合物[9]，主要结构由葡萄糖末端连接可变数目的半乳糖单元组成，半乳糖单元的数目通常为2～5[10]，半乳糖单元通过β(1→3)，β(1→6)和β(1→4)键连接，而半乳糖-葡萄糖键在大多数情况下是β(1→4)[11]。不同来源的酶合成低聚半乳糖是有差异的，其中低聚半乳糖主要包含三糖、四糖、五糖，以及异乳糖和半乳二糖[12]。

低聚半乳糖是一种调节结肠微生物菌群的益生元，具有改善矿物质吸收和预防结肠癌的功效[13]。研究表明，低聚半乳糖大大增加了双歧杆菌的数量及其在肠道中的代谢活性[14-16]，可降低过敏发生率[17-18]和病原体的黏附[15,18-19]，并且能介导肠道免疫系统。此外，低聚半乳糖有效治疗代谢性疾病[20]。因此，低聚半乳糖广泛应用在饮料和婴儿奶粉的配方中[21]。

我国目前仍存在β-半乳糖苷酶产量低的问题，从而限制了β-半乳糖苷酶在工业中的应用。如何寻找一种高产、高酶活的β-半乳糖苷酶仍是国内研究的难点。缪明永课题组的Wang等[22]对中国东海海水和海泥来源的海洋微生物进行筛选，获得了1株产S62β-半乳糖苷酶的盐单胞菌S62(Halomonassp. S62)，并对其低温β-半乳糖苷酶基因(GenBank登录号JQ337961)进行了重组表达研究。

在以上基础上，笔者对S62β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反应条件进行探索，以获得最大低聚半乳糖产率，以期为利用低温β-半乳糖苷酶进行工业生产低聚半乳糖提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

一水合乳糖、葡萄糖、半乳糖，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，TEDIA公司。

电热恒温水浴锅，上海医用恒温设备厂；超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(UPLC-Q-TOF-MS)、高效液相色谱仪(HPLC)，美国Waters公司。

1.2 低聚半乳糖的检测

1.2.1 低聚半乳糖种类检测

采用 Waters Acquity BEH Amide柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)分离，质谱检测器，时间为20 min。流动相A相：80%乙腈加0.1%氨水；B相:30%乙腈加0.1%氨水。柱温45 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1 μL。线性梯度洗脱程序见表1。

表1 LC-MS洗脱条件

注：质谱离子化方式为负离子(ESI-)，毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为20 V，脱溶剂气温度为400 ℃，脱溶剂气流速为700 L/h，碰撞能量为6 eV，质量范围为10～1 000，检测电压为1 800 V。二级质谱碰撞能量为6 eV，锥孔电压为50 V，选择离子质荷比为341、503、665。

1.2.2 低聚半乳糖含量的检测

实验采用双柱法检测[23-24]，并计算低聚半乳糖含量。

葡萄糖和半乳糖检测：用伯乐公司的Aminex HPX-87C柱(300 mm×7.8 mm，9 μm)测出葡萄糖和半乳糖含量，流动相为纯水，检测器为示差检测器，流速为0.6 mL/min，柱温为50 ℃，检测器灵敏度为8，检测器温度为30 ℃，进样量为20 μL。

乳糖检测：使用Waters公司的Amide柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)测出乳糖含量，流动相为70%乙腈，检测器为示差检测器，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，检测器灵敏度为8，检测器温度为30 ℃，进样量为20 μL。

低聚半乳糖质量分数计算见式(1)。

w(GOS)=w(Lac)-w1(Gal)-w1(Glu)-
w(H+)-w1(Lac)

(1)

式中：w1(Gal)=w(Gal)×(180-17)/180；

w1(Glu)=w(Glu)×(180-1)/180；

w(H+)=[n(Glu)-n(Gal)]×1。

w(Gal)、w(Glu)、w(Lac)、w1(Lac)分别为水解半乳糖质量分数、水解葡萄糖质量分数、初始乳糖质量分数、反应后乳糖质量分数；n(Glu)、n(Gal)分别为葡萄糖和半乳糖的摩尔数。

乳糖消耗率和低聚半乳糖产率的计算见式(2)和(3)。

乳糖消耗率=w1(Lac)/w(Lac)×100%

(2)

低聚半乳糖产率=w(GOS)/w(Lac)×100%

(3)

1.3 单因素条件优化

1.3.1 pH对低聚半乳糖合成的研究

用磷酸缓冲液配制pH为6.0～8.0的乳糖溶液，质量浓度为250 g/L，用纯水配制酶液600 U/mL，取1.9 mL乳糖溶液加入0.1 mL酶，在30 ℃下反应6 h。计算出低聚半乳糖产率及乳糖消耗率。

1.3.2 底物浓度对低聚半乳糖合成的研究

采用单一变量法控制反应，底物质量浓度为150～350 g/L，pH为7.0，其他条件如1.3.1节所述。计算出低聚半乳糖产率及乳糖消耗率。

1.3.3 温度对低聚半乳糖合成的研究

采用单一变量法控制反应，反应温度为25～45 ℃，pH为7.0，其他条件如1.3.1节所述。计算出低聚半乳糖产率及乳糖消耗率。

1.3.4 反应时间对低聚半乳糖合成的研究

采用单一变量法控制反应，反应时间为4～12 h，pH为7.0，其他条件如1.3.1节所述。计算出低聚半乳糖产率及乳糖消耗率。

1.3.5 加酶量对低聚半乳糖合成的研究

采用单一变量法控制反应，加酶量为15～75 U/mL，pH为7.0，其他条件如1.3.1节所述，计算出低聚半乳糖产率及乳糖消耗率。

1.4 低聚半乳糖合成正交试验

在前期的基础上，控制反应时间为4 h，以温度、底物浓度、pH、加酶量为考察因素，以低聚半乳糖含量为指标，进行L9(34)的正交试验。

1.5 最适条件低聚半乳糖合成及酶稳定性

在正交最适条件下进行反应8 h，定时取样，使用HPLC测糖组分，并测定40 ℃下酶的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 低聚半乳糖种类鉴定

通过液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定S62β-半乳糖苷酶合成低聚糖的种类，结果如图1所示。

由图1可知：出峰时间8.71、9.17和9.72 min为3种二糖，其质谱图依次为b、c、d，分别为乳糖、异乳糖和半乳二糖；出峰时间11.30和12.25 min为2种低聚半乳三糖，质谱图为e、f；出峰时间13.51和14.23 min为2种低聚半乳四糖，质谱图为g、h。此前，Rodriguez-Colinas等[25]鉴定了来自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶产生的低聚半乳糖混合物中的5种低聚半乳糖。Urrutia等[26]从米曲霉的β-半乳糖苷酶产生的低聚半乳糖混合物中发现了9个种类。Yanahira等[27]从环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶产物中分离出11种低聚半乳糖。S62β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成了6种低聚半乳糖，可以看出S62β-半乳糖苷酶同样具有较高的转糖基酶活。

(a)—选择离子色谱图；(b)、(c)、(d)—二糖质谱图；(e)、(f)—三糖质谱图；(g)、(h)—四糖质谱图图1 低聚半乳糖种类分析Fig.1 Analysis of types of GOS

2.2 pH对低聚半乳糖合成的影响

Torres等[5]总结了细菌β-半乳糖苷酶转糖基反应最适pH为6.0～8.0。以磷酸盐缓冲液控制反应体系pH，考察pH对低聚半乳糖合成的影响，结果如图2所示。

由图2可知：S62β-半乳糖苷酶在pH 6.0～8.0稳定性较好，表现出较好的转糖基作用，低聚半乳糖产率为26%～30%，乳糖转化率为69%～75%，其中在pH为7.0时，有最大低聚半乳糖产率(29.46±0.66)%，乳糖消耗率为(73.40±0.85)%。因此，在此反应体系中，最适pH为7.0。

2.3 底物浓度对低聚半乳糖合成的影响

在乳糖存在时，β-半乳糖苷酶存在着水解活性与转糖基化活性相互竞争现象，即当反应开始时，乳糖浓度较高，转糖基作用占主导作用，但是随着反应进行，水解活性逐渐增强，最终生成葡萄糖和半乳糖[28]。由此可见高浓度的乳糖有利于低聚半乳糖的合成。因此，选择150～350 g/L的乳糖，研究其对低聚半乳糖合成的影响，结果如图3所示。

由图3可知：当乳糖质量浓度大于200 g/L时，乳糖转化率随着底物浓度的增加逐渐降低，其原因主要是在一定的反应时间内，底物过饱和，酶结合底物能力有限，进而转化率下降；而底物质量浓度为150 g/L时，底物浓度降低，酶水解活性增强，导致乳糖和低聚半乳糖被降解为葡萄糖和半乳糖。所以当酶量为30 U/mL，反应时间为6 h，底物质量浓度为200 g/L，其低聚半乳糖产率为(26.57±0.36)%，乳糖消耗率最高为(67.40±0.55)%。

2.4 温度对低聚半乳糖合成的影响

低温酶在低温条件下通常保留着较高的酶活。Fan等[29]等研究了来自Rahnellasp. R3的低温β-半乳糖苷酶，以乳糖为底物，在4～35 ℃的宽温度范围内显示高活性；Coker[30]报道了AntarcticArthrobacterβ-半乳糖苷酶以乳糖为底物时最适为15～20 ℃。笔者研究了温度对低聚半乳糖合成的影响，结果如图4所示。

由图4可知：乳糖存在时，S62β-半乳糖苷酶同样在25～45 ℃时，表现出较高的酶活，最适转糖基化温度为40 ℃，此时低聚半乳糖产率为(36.15±0.01)%，乳糖消耗率为(82.45±0.01)%。温度过高时，S62β-半乳糖苷酶在较短的时间内失活，导致温度为45 ℃时的酶活比40 ℃时的酶活下降明显。

图2 pH对低聚半乳糖合成的影响Fig.2 Effects of pH on GOS synthesis

图3 乳糖浓度对低聚半乳糖合成的影响Fig.3 Effects of lactose concentration on GOS synthesis

图4 温度对低聚半乳糖合成的影响Fig.4 Effects of temperature on GOS synthesis

2.5 加酶量对低聚半乳糖合成的影响

在酶催化过程中为了保证底物高效利用以及产物高得率，酶用量适当是关键因素。S62β-半乳糖苷酶加酶量的实验结果如图5所示。

由图5可知：当加酶量为15 U/mL时，加酶量低，转化效率不高，乳糖消耗率和低聚半乳糖产率都最低；当加酶量为75 U/mL时，加酶量高，在6 h内反应速度过快，乳糖消耗率最高，但低聚半乳糖产率降低，此时低聚半乳糖更多的被降解。所以在此反应体系中，S62β-半乳糖苷酶最适加酶量为60 U/mL，此时乳糖消耗率为(82.51±0.79)%，GOS转化率为(33.88±0.01)%。

图5 加酶量对低聚半乳糖合成的影响Fig.5 Effects of enzyme amount on GOS synthesis

2.6 反应时间对低聚半乳糖合成的影响

β-半乳糖苷酶反应工艺中要求的是高效高产低耗，所以反应时间的控制有利于提高工艺效率。S62β-半乳糖苷酶的反应时间对合成的影响结果如图6所示。

由图6可知：乳糖消耗率随着反应时间的增加而增加，但低聚半乳糖产率先增加后降低，在反应时间为10 h时，低聚半乳糖产率达到最大值，为(33.1±0.32)%，乳糖消耗率为(77.87±0.28)%。

图6 反应时间对低聚糖合成的影响Fig.6 Effects of time on the GOS synthesis

2.7 低聚半乳糖合成正交试验

在以上的单因素条件基础上，设定反应时间为4 h，以底物浓度、反应温度、加酶量、pH为考察对象，设计正交试验表如表2所示，试验结果和结果分析如表3和表4所示。

表2 正交试验设计表

表3 正交试验结果表

表4 结果分析表

由表2～4可知：最适反应条件为反应温度40 ℃、底物质量浓度300 g/L、反应pH 7.0、加酶量50 U/mL，得到最高低聚半乳糖产率为(37.87±0.11)%，此时乳糖消耗率为(75.90±0.43)%。不同因素对低聚半乳糖产率的影响顺序从大到小依次为底物浓度、加酶量、pH、温度。

2.8 低聚半乳糖合成最适条件

在上述正交试验结果的最优反应体系下，每隔1 h取样1次，结果如图7所示。

由图7可知：低聚半乳糖产率和乳糖降解率随着反应时间的延长而增加，在4～8 h内，低聚半乳糖产率都维持在40%，在反应6 h时可获得最大低聚半乳糖产率(41.91±0.27)%，乳糖消耗率为(82.47±0.38)%。

目前，大部分β-半乳糖苷酶用于合成低聚半乳糖时，乳糖的高效利用率和低聚半乳糖高产率无法兼得。Aburto等[11]对米曲霉β-半乳糖苷酶进行了研究，在其最优反应体系中，低聚半乳糖产率为40%，40.3%的乳糖发生转化，但其乳糖利用率不高。Geiger等[31]报道了嗜热链球菌β-半乳糖苷酶在37 ℃、80%乳糖转化时，低聚半乳糖产率达到总糖含量的34.2%；在94%～95%的乳糖转化率下，低聚半乳糖产率降低至30%，乳糖利用率高，但低聚半乳糖产率低。Vasiljevic等[32]报道了保加利亚乳杆菌的β-半乳糖苷酶以质量分数30%的乳糖为底物，在50 ℃下获得最佳的低聚半乳糖产量，为20%。而本研究中的S62β-半乳糖苷酶在乳糖转化率接近90%时，反应4～6 h时，低聚半乳糖产率始终可保持40%以上，所以S62β-半乳糖苷酶可以在较长的时间内维持高低聚半乳糖产量。

对40 ℃下S62β-半乳糖苷酶剩余酶活进行检测，8 h时酶活仅剩60%左右。由于S62β-半乳糖苷酶属于低温酶，温度高时，酶的半衰期短，后期酶活降低，减慢了低聚半乳糖的水解，这也可能是低聚半乳糖产率在长时间内维持在40%以上的原因之一。

图7 最适条件反应结果及剩余酶活变化Fig.7 Optimum reaction conditions and the remaining changes of enzyme activity

3 结论

笔者对S62β-半乳糖苷酶产低聚半乳糖工艺进行了研究，反应体系为1.9 mL反应液，0.1 mL酶液，得到最适产低聚半乳糖条件如下：反应温度40 ℃、底物质量浓度300 g/L、反应pH 7.0、加酶量50 U/mL，反应6 h时可获得最大低聚半乳糖产率(41.91±0.27)%，此时乳糖消耗率为(82.47±0.38)%。反应4～8 h内，低聚半乳糖产率均维持在40%以上。而在本实验中，当乳糖转化率接近90%时，低聚半乳糖产率仍可维持在40%左右，即乳糖转化率与低聚半乳糖产率均可维持在较高水平，不仅获得了高附加值的产物，也在一定程度上提高了原料的利用率，这可为后续的S62β-半乳糖苷酶工艺应用提供技术参考，同时也有利于低聚半乳糖的工业化生产。