响应面法优化链霉菌S10A09发酵产纤维素酶条件

霍光明，张李阳，朱枳穆，俞丽娜

(1.南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京211171； 2.江苏省高校“特殊生物质废弃物资源化利用”重点建设实验室，江苏南京211171)

纤维素酶在许多工业应用过程中都起着重要作用，已被用在食品加工、纸张回收、清洁生产和动物饲料添加剂等领域[1-2]。将木质纤维素转化为大宗化学品是一项具有挑战性的中心工作[3]。因此，寻找转化效率高、稳定性好、适应能力强且价格便宜的产纤维素酶菌株是研究热点之一。

放线菌是一类具有降解纤维素能力的重要微生物，具有将纤维素转化为可发酵糖的能力，可用于生产大宗化学品,受到研究者关注[4-5]。链霉菌是放线菌中数量最大、研究最多的一类菌。链霉菌属中的许多种菌具有分解纤维素的能力，但一般分解纤维素能力较弱，且多为高温放线菌；虽然有中温放线菌对纤维素分解的报道，但大多仍属形态学、生态学方面的观察[1]。

本研究报道了1株来源于南京方山鞭蝎Typopeltiscrucifer肠道的链霉菌Streptomycessp.S10A09，具有较强的分解纤维素的能力，采用软件Minitab 15中的Plackett-Burman(PB)设计法、CCD中心组合设计法和响应面分析方法(RSM)对Streptomycessp.S10A09进行摇瓶发酵培养基的优化，以期为纤维素酶的生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种来源

从Typopeltiscrucifer肠道中分离获得的能降解纤维素的菌株Streptomycessp.S10A09，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保存编号为CCTCC M 2014462。

1.1.2 培养基

种子液培养基(羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基)(g/L)：CMC-Na 10、NH4NO31.0、酵母膏1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41.0。

发酵产酶培养基(g/L)： CMC-Na 10、(NH4)2SO44、KH2PO42、MgSO40.3、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.2、ZnSO40.002、MnCl20.002、CoCl20.002。

1.2 实验方法

1.2.1 产纤维素酶菌株液体发酵

将初筛到的菌株活化后接种于种子培养基中，培养温度28 ℃、摇床转速150 r/min的条件下培养4 d。种子液以体积分数10%接种量转接于装有100 mL产酶培养基中的体积250 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r/min的条件下培养4 d。

1.2.2 粗酶液的制备

将发酵培养液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上清液测定酶活。

1.2.3 纤维素酶活力的测定(DNS法)

1)总酶活(滤纸酶活力(FPA))测定。参照文献[7]并稍作修改。取稀释10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL 0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 4.8)和50 mg新华滤纸，以不加底物为对照，50 ℃反应60 min，加入3 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴5 min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18 mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测540 nm处的OD540值。

2)纤维素内切酶(羧甲基纤维素酶)活力测定。参照文献[8]并稍作修改。取稀释10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL、pH 4.8的1%CMC-Na溶液，对照管中不加底物，50 ℃反应30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18 mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测540 nm处的OD540值。

3)纤维素外切酶(微晶纤维素酶)活力测定。参照文献[9-11]并稍作修改。取0.5 mL稀释3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的微晶纤维素溶液(pH 4.8)，以不加底物为对照，50 ℃反应60 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18 mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测540 nm处的OD540值。

4)β-葡萄糖苷酶活力测定。参照文献[12]并稍作修改。取0.5 mL稀释3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的水杨苷溶液(pH 4.8)，以不加底物为对照，50 ℃反应30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再将试管置于冷水浴中，待试管冷却后，加入18 mL蒸馏水。以空白管做对照，采用分光光度计测540 nm处的OD540值。

5)FPA酶活力计算方法。酶活力定义：在pH 4.8、50 ℃条件下，每1 mL酶液在1 min内水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量称作一个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力=1 000Gn/(0.5t)

(1)

式中：G为所测得的OD540值在葡萄糖标准曲线上查出的还原糖质量浓度(mg/mL)，n为酶液的稀释倍数，1 000为毫克换算成微克，0.5为反应酶液的体积(mL)，t为酶和底物反应时间(min)。

1.2.4 菌株产纤维素酶的发酵条件优化

1)碳源对产酶的影响。在基础培养基的基础上，通过单因素实验，确定产纤维素酶的最佳碳源。分别以CMC-Na 10 g、葡萄糖5 g、玉米浆10 g、蔗糖5 g、甘油5 g、甲壳素5 g以及黄芪药渣粉10 g为碳源。生长好的种子液按照体积分数10%的接种量转接到发酵培养基中，30 ℃、150 r/min摇床培养5 d。发酵液在5 500 r/min下离心10 min，上清液即为粗酶液，测定其FPA。通过FPA确定最佳碳源。

2)氮源对产酶的影响。在确定最佳碳源的基础上，用不同的氮源代替发酵基础培养基中的(NH4)2SO4，选择的氮源有(NH4)2SO4、麸皮、蛋白胨、酵母膏和黄豆粉共5种氮源，将种子液以体积分数10%的接种量接种到发酵培养基中，30 ℃、150 r/min恒温振荡培养5 d。发酵液5 500 r/min离心10 min，得到的上清液即为粗酶液。通过测定FPA确定最佳氮源。

3)金属离子对放线菌产酶活性的影响。在碳氮源相同的情况下，选择7种金属离子进行筛选，研究对纤维素酶活力有影响的金属离子，见表1。

4)Plackett-Burman 实验设计和CCD中心组合设计。利用Minitab 15软件[13]，实验中选用N=12的 PB 设计，把每个因素设计成高(+1) 和低(-1) 2 个水平。然后根据PB实验筛选出的对纤维素酶活具有显著影响的因素，采用CCD中心组合设计方法进行实验条件优化，建立回归方程并进行响应面分析。

表1 对纤维素酶活力影响的7种金属离子

注：“+”表示含有该培养基成分；“—”表示未添加该培养基成分。

5)验证试验。根据PB和CCD实验建立的模型的最佳发酵条件进行验证实验，所有实验重复3次，测定FPA作为验证指标。

2 结果与讨论

2.1 碳源对产酶的影响

纤维素酶是一种诱导酶，因此纤维素既可以作为碳源来源，又可以作为主要诱导物。通过单因素实验筛选了7种不同的碳源进行发酵，结果见表2。

由表2可知，CMC-Na和葡萄糖作为碳源，产生的总酶活(FPA)最高可达43 U/mL以上。由于CMC-Na价格低于葡萄糖，且产生生物量大，综合考虑选择CMC-Na为碳源。

表2 碳源对产酶的影响

2.2 氮源对产酶的影响

在基础培养基基础上，通过单因素实验筛选5种类型的氮源进行发酵，测定不同氮源对产酶的影响，结果如表3所示。

由表3可以发现，以(NH4)2SO4组成的无机氮源发酵后产生的总酶活FPA最高，明显高于有机氮源的培养基。故选择(NH4)2SO4作为氮源。

2.3 金属离子对产酶的影响

通过单因素实验筛选不同类型的金属离子进行发酵试验，测定不同金属离子对产纤维素酶活力的影响，结果见表4。

由表4可知，Zn2+和Ca2+对产纤维素酶有抑制作用[16]，而K+和Fe3+缺少会降低酶活。

2.4 PB实验设计筛选重要因素

运用PB实验设计的方法，快速筛选出培养基不同类型成分中对放线菌Streptomycessp.S10A09 产纤维素酶影响的显著因素，PB实验结果和主效应分析见表5和表6。

表3 氮源对产酶的影响

表4 金属离子对产酶的影响

注：+表示含有该培养基成分；—表示未添加该培养基成分。

表5 Plackett-Burman试验结果

注：X1～X8分别代表CMC-Na、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4、NaCl、InSO4和CaCO3的质量浓度(g/L)。

由表5～6可知：影响Streptomycessp.S10A09产纤维素酶活的2个显著因素为X1和X2(P<0.05)，即CMC-Na和(NH4)2SO4质量浓度。采用2因素3水平的CCD试验寻找产酶条件的最佳组合。R2=95.41%，R2(调整)=83.18%，说明PB实验拟合度较高。

2.5 中心组合试验

2.5.1 CCD中心组合试验

根据PB设计实验筛选出对纤维素酶活具有显著影响的因素，采用中心组合设计方法进行实验条件的优化，实验平行3次，结果取平均值。实验设计和数据分析使用软件Minitab 15.0。中心组合实验变量水平及结果如表7所示。

表6 Plackett-Burman试验因素水平及其主效应分析

注：T为检验统计量；P值为检验P值，若P值小于5%，驳回归属假设。

表7 中心组合试验变量水平及结果

由表9可以看出，回归的整体、一次项、二次项P值均小于0.05，说明都显著有效；而交叉乘积项则不显著。失拟(Lack-of-Fit)值为0.10(大于0.05)，表示二次多项式回归模型正确。R2=97.33%，说明二次多项式回归效果非常好。

表8 滤纸酶活的估计回归系数

表9 滤纸酶活的方差分析

图1和2为依据回归方程绘出的响应面图。响应面代表着两个独立变量之间的相互作用。

由图1和2可见：CMC-Na(X1)对滤纸酶FPA活力的影响极其显著，表现为较陡的曲面；(NH4)2SO4(X2)对FPA活力影响较小，曲面较平滑。

图1 滤纸酶响应面图Fig.1 Response surface figure of filter paper activity

图2 滤纸酶响应面图及等高线图Fig.2 Response surface figure and contour map of filter paper activity

2.5.2 优化结果验证

根据模型预测，产酶最优条件为：X1=0.128 565(2.57 g/ L)，X2=1.414 210(11.31 g/L)，此时，预测的FPA最大响应值为126.54 U/mL。为了进一步确证模型预测的准确性，在优化的理论最佳条件下进行验证试验，所得FPA为125.96 U/mL，可见该模型能较好地预测实际发酵情况。且Strptomycessp.S10A09 产纤维素酶FPA接近优化前的3倍，高于已报道的Streptomycesruber、Streptomycesnoboritoensis等菌产纤维素酶的活性[14-16]。

3 结论

利用PB单因素、中心组合设计与响应面结合的方法，借助Minitab软件分析，对放线菌Strptomycessp.S10A09 产纤维素酶的发酵条件进行研究并得到优化结果，最终确定Strptomycessp.S10A09液体发酵产生纤维素酶的最优发酵培养基(g/L)为CMC-Na 2.57、(NH4)2SO411.31、KH2PO40.2、MgSO41、FeSO40.01。优化后，FPA达到125.96 U/mL，接近优化前的3倍。Strptomycessp.S10A09具有培养基简单、可利用无机氮源以及活性较高等特点，有利于工业化应用。在进一步研究中，将对其纤维素酶蛋白进行纯化，为进一步应用奠定基础。