利用农业废弃物发酵生产D-乳酸

孙家夺，吴 斌，何冰芳

(1. 上海泽润生物科技有限公司，上海201203；2. 南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京211800； 3. 南京工业大学药学院，江苏南京211800)

D-乳酸是多种手性化合物的合成前体，已广泛应用于化工、制药领域[1-2]。近年来发现其在提高聚乳酸材料的热稳定性、力学强度等方面具有显著作用，引起许多学者的研究兴趣[1,3-4]。

在D-乳酸发酵中，常使用葡萄糖为碳源，这使得发酵的碳源成本居高不下[4-5]。另外，在乳酸菌发酵过中，还需要额外添加某些维生素和氨基酸作为生长因子，酵母膏富含维生素和氨基酸，是常用的氮源，但其价格昂贵，使得氮源成本占到整个乳酸发酵成本的38%左右[6]。因此，寻找廉价物质作为发酵的碳氮源成为降低乳酸发酵成本的必然趋势[7-9]。玉米芯是玉米加工后剩下的废弃物，富含木质纤维素，可以水解为葡萄糖和木糖，是发酵工业极有价值的潜在碳源[9-10]。如张杰等[8]以稀硫酸处理的玉米芯水解液为原料，以细菌A-19为生产菌，发酵24 h，产生30.6 g/L的L-乳酸，转化率82.6%。此外，我国有丰富的棉籽粕、花生粕和菜籽粕等含氮量较高的农业副产品，这些都是潜在的发酵氮源[11-12]。孙骏飞等[13]报道了菊糖芽孢乳杆菌YBS1-5利用麸皮的蛋白酶水解液和纤维素酶水解液替代葡萄糖和酵母粉发酵制备D-乳酸，发酵96 h，D-乳酸产量达99.5 g/L，生产速率达1.04 g/(L·h)，转化率达89.1%；李媛等[14]通过以花生粕为氮源发酵，最终获得100 g/L以上的D-乳酸。然而，关于利用农业废弃物作为D-乳酸发酵的碳和氮源的报道较少。

本研究中，笔者主要尝试玉米芯酶解液替代葡萄糖，棉籽粕替代酵母膏，结合补料发酵技术生产D-乳酸，以期达到将农业废弃物资源化利用的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芽孢乳杆菌Sporolactobacillussp. YBS1-5(CCTCC M 2012516)是同型D-乳酸高产菌株[15]，保存于南京工业大学何冰芳教授实验室。

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉等，国药集团化学试剂有限公司；玉米浆，安徽丰原发酵技术工程研究有限公司；玉米芯，江苏康威生物技术开发有限公司；棉籽粕、菜籽粕、豆粕及玉米胚芽粕，徐州天源粮食加工厂；酸性纤维素酶，宁夏和氏璧生物技术有限公司(酶活力为555 FPU/L)。

1.3.4 玉米芯酶解液的制备

1.2 培养基

固体培养基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米浆 2 mL、KH2PO41 g、乙酸钠 2 g、MgSO40.2 g；pH 7.0。

种子培养基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米浆5 mL、MgSO40.2 g、麸皮 2 g、CaCO314 g；pH 7.0，接种量10%(体积分数)。

发酵基本培养基(1 L)：玉米浆 15 mL、麸皮 15 g、MgSO40.5 g。

周大国叹息一声说：“能确认。唉，毛主任可是我们医院的骨干，也是咱们江城有特别突出贡献的中青年专家，真想不到啊，我希望警方能尽早破案，还死者与死者家属一个公道。”

1.3 实验方法

用接种环将平板菌转接入装液量为 150 mL(500 mL摇瓶)的种子培养基，液体石蜡液封，在37 ℃、150 r/min的条件下，厌氧培养16 h。

将保存于-80 ℃的菌种，接种到固体培养基，在37 ℃厌氧培养箱内活化培养48 h后，再扩大培养，培养条件为37 ℃厌氧培养48 h。

其中，x(t)为液压介质被压缩的长度减小量随时间t变化的函数。由式(2)可以求解出产生半正弦波载荷的脉宽τ和压力峰值pmax分别为

1.3.2 种子培养

CAP是老年人常见的呼吸系统疾病，由于老年人常合并多种慢性疾病，机体免疫力处于衰退期，因此，发生CAP风险较高[11]。患者发病后，主要表现为咳嗽、咳痰、发热、呼吸困难等症状，严重可能引起感染性休克、呼吸衰竭等，具有较高的致死率[12]。机械通气是改善CAP患者呼吸状态的常用辅助手段，但由于需要进行插管等侵入性操作，增加了致病菌侵入呼吸道风险，可能引起VAP。据相关数据显示[13]，机械通气患者发生VAP比例可高达9%～70%。同时，VAP也是导致CAP患者死亡的主要原因之一。为稳定患者生命体征，改善患者肺功能，降低死亡率，应对患者加强护理干预。

1.3.1 固体培养

1.3.3 发酵培养优化

1)氮源对菌株YBS1-5发酵D-乳酸的影响。以豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕、玉米胚芽粕和酵母膏分别作为发酵氮源，考察其对YBS1-5生长，D-乳酸的产量、光学纯度和转化率的影响。添加100 g/L的葡萄糖，并用60 g/L CaCO3做中和剂调节pH，转速 150 r/min，培养温度 37 ℃。发酵在摇瓶中进行。

2)棉籽粕用量对菌株YBS1-5发酵产D-乳酸的影响。考察棉籽粕用量对菌株YBS1-5生长，产D-乳酸的产量、光学纯度和转化率的影响。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3 U/L中性蛋白酶，用10 mol/L的NaOH来维持发酵液pH为6.5。转速120 r/min，培养温度37 ℃。发酵在7 L发酵罐中进行。

姓李的老天爷撒手不管了，这可如何是好？天上的神仙可犯难了，最后大家一商量，到人间再去找一个老天爷。这个老天爷啊，一定要心地善良，做事公道、脾气又好，才能胜任。

1.4.3 发酵液生物量的测定

中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，诺维信(中国)生物技术有限公司，酶活力为1×104U/L；U-3000型高效液相色谱仪，赛默飞公司；SBA-40C型生物传感仪及相关标准液和缓冲液，山东省科学院生物研究所；木糖标准品、糠醛标准品和香草醛标准品，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；雷磁PHS-3E型pH计，上海精密科学仪器有限公司；ATN-1100型凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；Winpact发酵罐，Major Science公司。

唐诗的模糊美初探 ……………………………………………………………… 王华琴，张青华，张 红（5．76）

玉米芯的处理方法主要参考Ouyang等[10]报道的方法，并适当修正。具体步骤：①将粉碎的玉米芯用30 g/L H2SO4浸泡2 h，接着125 ℃下蒸汽爆破5 min；②用水进行清洗至中性，过滤，接着将固体残留物进行酶解。采用酸性纤维素酶进行水解，用量为15 FPU/g干物质；水解条件为在50 ℃、200 r/min条件下反应60 h，固液比1∶ 4(g/mL)。反应结束后，8 000 r/min离心20 min，取上清4 ℃保存备用。

1.3.5 补料发酵

在前期的实验中发现以100 g/L的还原糖作为补料发酵的初始糖浓度能够较好地消除底物抑制作用，因而将玉米芯酶解液稀释到还原糖总质量浓度为100 g/L，作为初始糖浓度进行D-乳酸发酵，发酵中添加3 U/L的中性蛋白酶发酵液和3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH维持发酵液pH 6.5进行补料发酵。转速120 r/min，培养温度 37 ℃。当葡萄糖质量浓度降到30 g/L时，补加浓缩的玉米芯酶解液，使得发酵液中的初始还原糖糖浓度维持在100 g/L左右。发酵在7 L发酵罐中进行。

1.4 分析方法

1.4.1 总氮量的测定

采用凯氏定氮法进行测定。

参照文献[15]，吸取一定量的发酵液于试管中，稀释合适倍数，用752紫外分光光度计于660 nm处测定吸光值，乘以稀释倍数得到其生物量OD660。

1.4.2 玉米芯酶解液成分的测定

1)葡萄糖和木糖含量测定。参照文献[15]，采用SBA-40C型生物传感分析仪进行测定。

2)木糖含量测定。参照文献[16]，采用HPLC氨基柱法，木糖标准曲线：Y=2.65×峰面积-0.042，R2=0.999。

第四，企业法人。《湖南省关于城中村集体经济组织产权制度改革的指导意见》规定，只要集体经济组织愿意申请，根据自己自身的资产状况，可以申请登记为有限责任公司。这里也是明确可以定位为企业法人。

3)糠醛和5-羟甲基糠醛含量检测。参照文献[17]，采用HPLC法测定，5-羟甲基糠醛标准曲线：Y=1.15×峰面积+5.77，R2=0.999 4；糠醛标准曲线：Y=1.29×峰面积+6.48，R2=0.999。

4)酚类含量检测。参照文献[18]，以香草醛标定酚类物质的含量，香草醛标准曲线为Y=0.079×OD756-5.978，R2=0.999。

3)水解棉籽粕的中性蛋白酶用量对菌YBS1-5发酵产D-乳酸的影响。考察中性蛋白酶使用量过滤除菌加到培养基中水解棉籽粕对菌YBS1-5发酵产D-乳酸的影响。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH 将发酵液pH 维持在6.5，转速 120 r/min，培养温度 37 ℃。发酵在7 L发酵罐中进行。

（1）对PM2.5检测传感器进行调试，对其实际响应声光提示进行记录，烟雾采集数据、声光提示记录如表1所示。

1.4.4 光学纯度的鉴定

参照文献[15]，发酵产物的光学纯度采用HPLC进行检测，标准曲线：Y=0.022 5×峰面积+0.018，R2=0.999，具体计算见式(1)。

综合型实验 此类实验需学生在掌握相关专业基础实验操作能力的基础上，使用多种实验技术来完成最终实验[9]。正是因为需要用到多种实验技术，综合型实验对于仪器的开放性及实验室的开放性要求更高。与基础验证型实验相比，综合型实验更能锻炼学生的协调能力，在专业实验课中应当占有一定比例。

D-乳酸光学纯度=

(1)

1.4.5 乳酸的定量分析

参照文献[15]，采用高效液相色谱法分析。

有的公司虽然已经认识到大数据对于企业发展的重要性，但是却因为没有较强的信息分析技术，导致数据的应用不能充分发挥其实际效用。我国很多企业受传统思想的禁锢，不能用发展的眼光去看待问题，用陈旧的技术对待新的数据，导致其根本不能最好的发挥价值。长此以往，企业就会失去很多发展机会。

1.4.6 D-乳酸发酵过程中糖酸转化率的分析

在同型D-乳酸发酵过程中，理论上1分子葡萄糖可以完全转化为两分子的D-乳酸，因此发酵过程中的糖酸转化率具体计算见式(2)。

送走陈主任，吕凌子独自来到与客厅相连的阳台上，阳台上有风，晾衣架上的衣服正在随风摇摆。吕凌子目光空洞地望着远方，一只黑色的小鸟从她面前一掠而过。吕凌子并不知道，此时此刻的刘丽芳同样在阳台上站着，就在自己脚下。两位女人各怀心事，都在为同一件事情纠结。

(2)

2 结果与讨论

2.1 氮源对菌株YBS1-5发酵产D-乳酸的影响结果

为了寻找可以替代酵母膏的廉价氮源，选择4种农业废弃物——豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕作为氮源。经测定，酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕的总氮量分别为5.8%、4.5%、6.2%、7.9%和4.2%，按照总用氮量与酵母膏相同的原则，最终它们的所用量分别为6.4、4.7、3.7和6.9 g/L。以60 g/L的CaCO3做中和剂，在摇瓶上考察不同种类氮源对菌株YBS1-5产D-乳酸的影响。其中将采用酵母膏做氮源时发酵所得到的D-乳酸糖酸转化率视作100%，其他4种氮源发酵产D-乳酸以此作为参考，所得的相对转化率如图1所示。由图1可知：酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕和玉米胚芽粕均可以不同程度地被菌株YBS1-5利用，其中，棉籽粕做氮源时D-乳酸的相对转化率最高(71.3%)，这比豆粕粉、菜籽粕和玉米胚芽粕做氮源时要高，因此，选择棉籽粕是替代酵母膏的潜在廉价氮源。

苏楠想去杨小水老家看看，了解一下她的为人。这个想法与李峤汝一拍即合。出了这事，李峤汝才发现，她对母亲几乎不了解。农村的母女或父子，大多都这样，亲情多，交流少。彼此的了解，除了衣食住行，所剩无几。

图1 氮源对菌株YBS1-5发酵产D-乳酸的影响Fig.1 Effects of different nitrogen sources on fermentation of D-Lactic Acid by YBS1-5

2.2 棉籽粕用量对菌YBS1-5产D-乳酸的影响结果

在添加3 U/L发酵液的中性蛋白酶条件下，用10 mol/L NaOH控制发酵液pH 6.5，考察棉籽粕用量(3.0、3.5、3.7、4.5和6.0 g/L)对菌YBS1-5发酵产D-乳酸的影响，结果见表1。

由表1可以看出，在一定的浓度范围内，菌YBS1-5产生的D-乳酸浓度随着棉籽粕用量增加而增加，当添加3.5 g/L的棉籽粕时，以100 g/L的葡萄糖发酵得到D-乳酸72 g/L。因此，添加3.5 g/L的棉籽粕是较为合适用量。

表1 棉籽粕用量对YBS 1-5产D-乳酸的影响

2.3 中性蛋白酶用量对菌株YBS1-5发酵产D-乳酸的影响结果

在添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH控制pH 6.5条件下，考察添加0、1.5、3.0、4.5、6.0和8.0 U/L的中性蛋白酶对菌株YBS1-5发酵产D-乳酸的影响,结果见图2。

由图2可知：在没有添加中性蛋白酶的情况下，菌株YBS1-5不能有效地利用棉籽粕，100 g/L的葡萄糖仅产生了40 g/L的D-乳酸，转化率仅为64%。当在发酵液中添加中性蛋白酶液时，菌YBS1-5产D-乳酸的用量也随着所添加的中性蛋白酶液用量的增加而迅速增加。当中性蛋白酶的添加量为3 U/L时，菌株YBS 1-5产生72 g/L D-乳酸，转化率为83%，说明棉籽粕水解较充分，氮源释放较完全，而当添加的中性蛋白酶液超过4.5 U/L时，D-乳酸的产量下降明显，可能是由于少量中性蛋白酶液残留所致。同时出于成本考虑，选择3 U/L的中性蛋白酶作为最适添加量。

图2 中性蛋白酶用量对菌YBS1-5产D-乳酸的影响Fig.2 Effects of different neutral protease usages on production of D-Lactic acid by YBS1-5

2.4 补料发酵的结果

经检测，玉米芯酶解液的主要成分：100 g/L葡萄糖、13 g/L木糖、0.97 g/L糠醛、9.4 g/L 5-羟甲基糠醛和0.29 g/L酚类物质。将玉米芯酶解液稀释到还原糖质量浓度为100 g/L，以此作为发酵初始糖浓度，在添加棉籽粕3.5 g/L，3 U/L的中性蛋白酶，10 mol/L NaOH控制pH 6.5情况下，当葡萄糖质量浓度降到30 g/L左右时，通过补加浓缩的玉米芯水解液使得总还原糖质量浓度为100 g/L左右(共补加含有大概550 g葡萄糖的浓缩液)，结果见图3。

图3 菌YBS1-5补料发酵产D-乳酸Fig.3 D-Lactic acid production from strain YBS 1-5 by feed fermentation

由图3可以看到，菌YBS1-5在90 h内积累了111.8 g/L的D-乳酸，残留7 g/L的葡萄糖，而由于菊糖芽孢乳杆菌本身缺少利用木糖的关键酶基因[19]，所以在整个发酵过程中木糖未被利用。发酵过程中平均生产速率、糖酸转化率以及光学纯度分别为1.24 g/(L·h)、87%和98%以上，光学纯度见图4。

这些数据表明：玉米芯酶解液中残留的少量糠醛、5-羟甲基糠醛和酚类物质及未脱棉酚的棉籽粕未对菌株YBS1-5产D-乳酸有明显的抑制作用，菌株YBS1-5能够有效地利用玉米芯水解液和棉籽粕做底物产D-乳酸。

地面坐标系是以接收机所在位置为坐标原点，正东方向为X轴正方向，Y轴为正北方向，Z轴铅锤向上三者构成的右手直角坐标系。机体坐标系原点为飞机中心(即雷达观测目标)，如图1所示，X轴正方向为平行于飞机机身轴线指向正前方，Z轴位于目标对称平面内，垂直于X轴指向飞机正上方，Y轴垂直于飞机对称平面，方向符合右手法则。同时，在飞机直线飞行时，认为飞机速度方向即飞机机体坐标系X轴正方向。被动雷达的雷达视线包括从辐射源到目标和从目标到接收机，在本文中选用的辐射源为导航卫星。考虑到飞机目标在直线飞行时，左右机翼水平，侧滚角始终为0°，为了简化模型，在本文中只考虑方位角和俯仰角。

图4 D-乳酸的光学纯度Fig.4 Optical purity of D-lactic acid

3 结论

本研究采用农业废弃物玉米芯酶解液和棉籽粕做为D-乳酸发酵的底物。在中性蛋白酶用量为3 U/L发酵液、棉籽粕3.5 g/L、初始还原糖质量浓度为100 g/L的情况下，通过2次补加，菌YBS1-5在90 h内产生了111.8 g/L的D-乳酸，转化率为87%，光学纯度达98%以上。本研究为经济有效利用农业废弃物生产D-乳酸提供了一种新的方法。