D-泛解酸内酯水解酶的固定化及酶学性质

王开放，张 梁，辛 瑜，曾 伟，丁重阳，石贵阳

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122； 2.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122； 3.大连韦德生化科技有限公司，辽宁大连116000)

D-泛解酸内酯被认为是生产D-泛酸的重要中间体，广泛用作食品和饲料添加剂[1]。D-泛解酸内酯水解酶作为酶源代替昂贵和有毒的化学拆分剂来处理DL-泛解酸内酯，成本较低且对环境无污染[2]，但是游离酶难以回收和重复利用，不利于工业生产的稳定和连续化，对该酶进行固定化研究成为大规模生产研究的热点[3-4]。例如Sakamoto等[5-6]利用固定化细胞技术对特定菌株进行固定化，选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-构型，将水解产物D-泛解酸分离出来，再经过内酯化转变成D-泛解酸内酯，此方法已由日本第一制药(FUJI)公司申请了专利，并投入工业化生产；汤一新等[7-9]利用海藻酸钠法和戊二醛交联固定化霉菌法对1株产D-泛解酸内酯水解酶的菌株FusariummoniliformeSW902进行固定化，成功应用于工业化生产；Yu等[10]利用海藻酸钙对镰孢霉菌属的Fusariumsp. BU-011进行固定化；黎明课题组[11-12]对腐皮镰孢菌酶(Fusariumproliferatumvar.proliferatumAS3.4783)破碎后，用大孔吸附树脂D380对破碎液进行了固定化研究，固定化酶活达到4 U/g树脂。然而目前所报道的对D-泛解酸内酯水解酶的固定化研究是以野生菌为出发菌株进行的，野生菌酶产量低，对酶的固定化造成了一定的困难[13]。

本研究中，笔者以前期构建的重组乳酸克鲁维酵母(KluyveromyceslactisGG799/pZL505-DL)所产的D-泛解酸内酯水解酶为酶源，进行固定化方面的研究，以期为工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-泛解酸内酯水解酶基因来源于串珠镰孢菌Fusariumverticillioides(GenBank:AY728018.1)，重组乳酸克鲁维酵母(KluyveromyceslactisGG799/pZL505-DL)，笔者所在课题组成员前期构建；DL-泛解酸内酯，安徽酷尔生物工程有限公司；D-泛解酸内酯，美国Sigma公司；其他试剂均为市售国产分析纯。

高效液相色谱仪(chromaster)，日本日立公司；HYL-C型组合式摇床，太仓市实验设备厂；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽，上海森信试验仪器有限公司；AL104型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化载体的筛选

选择树脂D301、树脂D315、树脂D380、琼脂糖颗粒和杂化纳米花hybrid nanoflowers (hNFs)，对D-泛解酸内酯水解酶的固定化效果进行初筛，确定最佳的固定化载体。

1.2.2 固定化方法的确定

取适量经过处理的树脂放入50 mL锥形瓶中，每种树脂每瓶添加1 g，各设3个平行，放入总酶活为12 U的酶液，然后置于摇床中，30 ℃、200 r/min 吸附3 h，在4 ℃预冷，再加入适宜浓度的戊二醛，交联1 h，最后用去离子水反复冲洗除去游离酶。

琼脂糖颗粒固定化参照文献[14]。

hNFs的固定化参照文献[15]。

1.2.3 酶学性质研究

酶活定义：在一定条件下，每分钟水解1 μmol D-泛解酸内酯所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

D-泛解酸内酯的HPLC测定方法：将反应后样品12 000 r/min离心30 min，取200 μL于内衬管中。色谱柱为ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm×3.5 μm，流速0.5 mL/min，紫外检测波长为215 nm，柱温25 ℃，流动相组成为V(乙腈)∶V(KH2PO4(0.02 mol/L)=1∶ 19，用稀盐酸调pH至3.0，进样量10 μL。

游离酶和固定化酶最适反应温度的测定：以质量分数4%D-泛解酸内酯水溶液为底物，以pH 7.5的2 mol/L Tris-HCl为缓冲液，将底物和缓冲液在各个温度条件下预热5 min后加入适量酶液，反应一定时间后，进行酶活测定，以灭活的酶作为空白对照。

固定化酶和游离酶的温度耐受性测定：以质量分数4%D-泛解酸内酯水溶液为底物，以pH 7.5的2 mol/L Tris-HCl为缓冲液，取固定化酶和游离酶，并在各个温度条件下放置30 min， 之后将各个温度处理过的游离酶和固定化酶取出适量，以未处理的游离酶作为对照，反应一定时间，测定剩余酶活力。

固定化酶和游离酶的最适pH测定：以质量分数 4%D-泛解酸内酯水溶液为底物，取适量酶液，在不同pH条件下反应一定时间后，进行酶活测定。

固定化酶和游离酶的pH耐受性：将固定化酶和游离酶在不同的pH缓冲液保温1 h后测定其剩余酶活力。

1.2.4 固定化酶填充床反应

为探究固定化酶的高浓度底物水解效果和测定拆分产物的光学纯度，自制填充床反应器。拆分产物D-泛解酸内酯的提取方法：将经填充床反应的高浓度底物用相同体积的乙酸乙酯萃取，有机相萃取未参加反应的L-泛解酸内酯和剩余的D-泛解酸内酯，待分层后，有机相用旋转蒸发仪获得DL-泛解酸内酯，水相加盐酸调pH至1.0，静置12 h，再次用乙酸乙酯萃取，蒸干有机相获得结晶，即D-泛解酸内酯粗品。取适量结晶，溶于水后用全自动旋光仪测定旋光度。

2 结果与讨论

2.1 酶的固定化

2.1.1 固定化载体的确定

利用树脂D301、树脂D315、树脂D380、琼脂糖颗粒和hNFs进行D-泛解酸内酯水解酶的固定化预试验，结果如表1所示。

由表1可知：在弱碱性阴离子树脂中只有D380固定化酶检测到酶活，推测该树脂的功能基团和骨架结构有利于该酶的固定化；hNFs法不适用于该酶的固定化；用琼脂糖颗粒进行酶的固定化，由于其固定化方法的复杂，成本较高，且酶活回收率和比酶活均低于树脂D380。因此本实验中,笔者选用D380作为固定化载体，进行固定化研究。

表1 载体对固定化酶活力的影响

2.1.2 固定化加酶量的选择

取1 g预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，放入酶量分别为9、12、15、20、30、50、80、160、200和300 U/g的树脂，吸附时间为3 h，吸附温度为30 ℃，吸附酶液的pH为7.0，戊二醛终体积分数为0.2%，交联时间为1 h,结果如图1所示。

由图1可知：随着酶量的增加，固定化的比酶活逐渐增加。可能由于随着酶量的增加，酶分子与树脂功能基团上结合的概率越来越大，到约30 U/g树脂时，吸附达到饱和，此时固定化比酶活为(8.60±0.16) U/g，高于此加酶量，固定化酶的比酶活增加不明显，所以选择的加酶量为30 U/g树脂。

图1 加酶量对固定化效果的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on immobilization

2.1.3 固定化pH的选择

取预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，每瓶放入1 g湿树脂，将酶液的pH分别调为6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，加酶量为30 U/g树脂，吸附时间为3 h，吸附温度为30 ℃，戊二醛终体积分数为0.2%，交联时间为1 h，结果如图2所示。

由图2可知：在pH为7.5时，固定化效果最好，所以选择的固定化pH为7.5，其固定化比酶活为(9.60±0.21) U/g。D380是阴离子交换树脂，pH只有大于蛋白的等电点，才能更好地发挥与载体之间的吸附交联作用，但pH过大则会影响酶的催化效果。

图2 pH对固定化效果的影响Fig.2 Effect of pH on immobilization

2.1.4 固定化吸附时间的选择

取预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，每瓶放入1 g湿树脂，吸附时间分别设为1、2、3、4、5、7 和9 h，吸附pH为7.5，选择的加酶量为30 U/g树脂，吸附温度为30 ℃，戊二醛终体积分数为0.2%，交联时间为1 h，结果如图3所示。

由图3可知：最佳的吸附时间为5 h，比酶活为(10.9±0.16) U/g；时间超过5 h，固定化效果出现下降的趋势，推测是由于长时间的振摇导致酶部分失活。

图3 吸附时间对固定化效果的影响Fig.3 Effect of adsorption time on immobilization

2.1.5 固定化吸附温度的选择

取预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，每瓶放入1 g湿树脂，吸附温度分别为10、15、25、30、35、40和45 ℃，吸附时间为5 h，吸附pH为7.5，选择的加酶量为30 U/g树脂，戊二醛终体积分数为0.2%，交联时间为1 h，结果如图4所示。

由图4可知：在10～30 ℃时，随温度的升高固定化效果越好，30 ℃固定化酶的比酶活最高，为(11.2±0.14) U/g，可能是由于温度升高，分子运动加剧，加快了酶分子与载体之间的相互作用；高于此温度时，固定化效果下降趋势明显，推测该酶在较高温度下酶活力下降较快，因此选择最佳的吸附温度为30 ℃。

图4 吸附温度对固定化效果的影响Fig.4 Effect of adsorption temperature on immobilization

2.1.6 戊二醛体积分数对固定化效果的影响

取预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，每瓶放入1 g湿树脂，交联的戊二醛体积分数分别设定为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%和0.4%，吸附温度为30 ℃，吸附时间为5 h，吸附pH为7.5，选择的加酶量为30 U/g树脂，交联时间为1 h，结果如图5所示。

由图5可知：戊二醛体积分数高于0.1%时，固定化酶的比酶活变化不大，且比酶活已达到最高，为(11.3±0.32) U/g，戊二醛浓度较低时，只有少量的酶蛋白与载体交联，且与载体结合不牢固，过高的戊二醛浓度也会使酶失活，所以选择戊二醛体积分数为0.1%。

图5 戊二醛体积分数对固定化效果的影响Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on immobilization

2.1.7 交联时间对固定化效果的影响

取预处理的湿树脂于50 mL锥形瓶中，每瓶放入1 g，戊二醛交联的时间分别设为0.5、1、1.5、2、3和4 h，选择的戊二醛体积分数为0.1%，吸附温度为30 ℃，吸附时间为5 h，吸附pH为7.5，选择的加酶量为30 U/g树脂，结果如图6所示。

由图6可知：交联时间为1 h时，固定化效果最好，比酶活达到(11.5±0.12) U/g，随着时间的增加，交联反应逐渐结束，固定化酶比酶活力不再增加，因此选择最佳的交联时间为1 h。

图6 交联时间对固定化效果的影响Fig.6 Effect of cross-linking time on immobilization

通过以上方法对重组乳酸克鲁维酵母所产D-泛解酸内脂水解进行固定化，得到的固化酶制剂为11.5 U/g，相对黎明等[11]得到的4 U/g的固定化酶，具有一定的优势。

2.2 酶学性质研究

2.2.1 酶反应的最适温度

温度的升高一方面能够加快反应速度，提高酶活，另一方面会使蛋白变性，导致酶失活。探究不同温度对固定化酶和游离酶的酶活影响，以最高酶活为100%，测定的温度分别为20、25、30、37、40、45、50、55、60、65、75和85 ℃，结果如图7所示。

由图7可知：温度在37 ℃时酶活力最高，高于此温度时，酶失活的速度大于提高酶活的速度，所以选择游离酶和固定化酶的最适反应温度为37 ℃。

图7 温度对酶活的影响Fig.7 Effects of temperature on enzyme activity

2.2.2 酶的热稳定性

以未经处理酶的酶活为100%，将纯酶分别置于20、25、30、37、40、45、50、55、60、65、75和85 ℃条件下反应30 min，然后测定酶活，结果如图8所示。

由图8可知：在50 ℃处理30 min，固定化酶仍保有约最高酶活力的75%，而游离酶只剩余约最高酶活力的45%，固定化酶的热稳定性高于游离酶，推测是由于固定化载体对酶蛋白具有一定的保护作用。

图8 温度对酶稳定性的影响Fig.8 Effects of temperature on enzyme stability

2.2.3 酶反应的最适pH

用不同pH的PBS缓冲液(pH 4.5～7.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 7.0～9.5)配制底物，配制的底物在半小时内进行酶活测定，同时用灭活的酶作为对照，减少自发水解带来的误差，结果如图9所示。

由图9可知：酸性条件下底物基本未水解，推测原因是底物水解的反馈抑制作用引起的。pH>8时，酶活最高，但此时底物的非特异性水解率较高，得到的D-泛解酸内酯的光学纯度相对较低。综合底物自发水解的情况，选择酶反应的最佳pH为7.5。

图9 pH对酶活的影响Fig.9 Effects of pH on enzyme activity

2.2.4 酶pH的稳定性

用不同pH的PBS缓冲液(pH 4.5～7.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 7.0～9.5)稀释浓缩的酶液，30 ℃放置2 h，然后测定剩余酶活力，以不经过处理的酶的酶活力作为100%，结果如图10所示。

由图10可知：固定化酶对低pH的耐受性高于游离酶，可能是由于载体表面的基团对周围微环境的pH起到一定的缓冲作用。在pH 9.5条件下游离酶和固定化酶的剩余酶活力仍达到75%以上，表明该酶适宜在碱性条件下储存。

图10 pH对酶稳定性的影响Fig.10 Effects of pH on enzyme stability

2.2.5 金属离子对酶反应的影响

金属离子对固定化酶和游离酶的影响如图11和12所示。

由图11和12可知：Ca2+对游离酶和固定化酶的酶活有激活作用，Mn2+和Zn2+对游离酶和固定化酶有明显的抑制作用，固定化酶对Cu2+、Ni2+和Co2+等离子的耐受性高于游离酶。

图11 金属离子对固定化酶酶活的影响Fig.11 Effects of metal ions on immobilized enzyme activity

图12 金属离子对游离酶酶活的影响Fig.12 Effects of metal ions on free enzyme activity

2.3 米氏常数的测定

米氏常数Km是酶催化反应的最基本的特征常数，在同一条件下只与酶的性质有关，与酶的浓度无关，Km越大表示酶与底物的亲和性越小[16]。

由于游离酶和固定化酶的反应体系和比酶活力不同，为测定方便，以D-泛解酸内酯为反应底物，选择测定固定化酶动力学参数的反应底物质量浓度为8、10、12、16、20、24、36、50、60和70 g/L，游离酶动力学参数的反应底物质量浓度为10、20、30、40、60、70、80、90和100 g/L，利用双倒数法测定D-泛解酸内酯水解酶的动力学常数，以底物浓度的倒数S-1为横坐标，初始反应速率的倒数v-1为纵坐标，绘制的双倒数图如图13所示。经计算得出游离酶Km=170.25 mmol/L，固定化酶Km=207.601 mmol/L，固定化酶对底物的亲和力比游离酶对底物的亲和力弱，可能是由于固定化酶的空间位阻较大，不利于底物扩散。

图13 固定化酶和游离酶的动力学曲线Fig.13 Kinetic curves of immobilized and free enzymes

2.4 固定化酶填充床反应

在水解较高浓度底物(25%)时，缓冲液难以有效控制pH的下降，导致水解反应难以继续进行，为此，笔者设计小型的水解装置(图14)，免去了手动每隔10 min添加氨水调pH的操作，也保持了酶水解反应的稳定进行，每隔一定时间取少量反应液测定pH和水解率，并校正氨水流加速率，底物总量为30 mL，氨水总添加量约4 mL，结果见图15。

由图15可知：在反应约6 h时，水解率达到27%，水解效率较高,延长反应时间，水解率升高缓慢。经拆分得到的D-泛解酸内酯的光学纯度为97.8%，该固定化酶催化效率达到工业化生产的要求。

图14 固定化酶水解装置Fig.14 The device of immobilized enzyme hydrolysis

图15 固定化酶水解的时间曲线Fig.15 Time curve of immobilized enzyme hydrolysis

2.5 固定化酶的操作稳定性

对固定化酶填充床反应器进行操作稳定性实验，反应底物的质量分数为20%～25%，每批的反应时间为4～6 h，以第1批次的酶活为100%，进行15批次的实验，结果如图16所示。

由图16可知：固定化酶填充床反应器在使用15次之后，酶活降低为原来的70%左右，但增加反应时间，水解率仍能达到30%，与华蕾等[17]得到平均批反应时间7 h、水解率35%～40%的固定化细胞水解效率相当，具有一定的实用价值。

图16 固定化酶的操作稳定性Fig.16 Operating stability of immobilized enzyme

3 结论

对D-泛解酸内酯水解酶的固定化进行研究，确定使用的固定化载体为大孔吸附树脂D380，以戊二醛作为交联剂，对固定化条件进行了优化，较优的结果为：酶的吸附添加量为30 U/g湿树脂，吸附pH 7.0，吸附温度30 ℃，吸附时间5 h，戊二醛体积分数0.1%，戊二醛交联时间1 h，在此固定化条件下得到的固定化酶的比酶活为(11.5±0.12) U/g。研究得到游离酶和固定化酶的最适反应温度均为37 ℃，在20～40 ℃时有较好的稳定性，最适反应pH均为7.5，反应pH低于7时，固定化酶和游离酶表现为无酶活。游离酶的动力学常数Km为170.25 mmol/L，固定化酶的动力学常数Km为207.60 mmol/L，Ca2+对酶促反应有激活作用，Mn2+对该酶有较强的抑制作用。

后续实验将进一步探究合适的固定化酶反应器，实现固定化酶对DL-泛解酸内酯催化反应的自动化和连续化操作。