千层金精油含量和成分变化规律研究

杨 超，张恕杰，刘文嵩，王文婷，王志恒，吴少华*，李永裕*

1福建农林大学园艺学院；2福建农林大学园艺植物天然产物研究所，福州 350002

千层金(Melaleucabracteata)又名黄金宝树、黄金香柳、澳洲杉、包鳞白千层以及黄金串钱柳，是原产自荷兰、新西兰、澳大利亚等濒海国家的喜光常绿乔木。千层金不仅具有观赏价值，其植株中所含的精油更是具有许多的优良特性，国内外研究表明，千层金精油对实蝇属害虫具有引诱效果[1，2]，目前已有越来越多的国家开始关注将千层金精油用于农业生产上对实蝇的防治。此外千层金叶片精油对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、紫色杆菌、红色粘质沙雷氏菌、白色粘质沙雷氏菌等具有不同程度的抗菌效果[3，4]，因此，千层金精油有望开发成为防控实蝇类害虫和防治植物细菌性病害的新型生物农药。然而，目前对千层金精油的开发利用研究主要集中在精油提取工艺的优化和成分分析方面[4-6]，尚未考虑环境因素对精油含量和成分的影响。

植物精油属于次级代谢产物，其合成和积累受到环境条件的影响[7]。高温多雨促进植物光合速率、次级代谢以及精油的积累，而气温低、降水少则影响光合作用以及碳合成的效率，造成次级代谢中精油合成下降，精油含量降低，这种规律在大马士革玫瑰(RosadamascenaMill.Landraces)[8]、迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)[9，10]、永州香樟(CinnamomumcamphoraL.)[11]、姜黄(CurcumalongaL.)[12]、洋甘菊(MatricariarecutitaL.)[13]等植物中都得到了验证。但精油含量和成分的变化与环境之间的内在规律还需进一步的研究探讨。

本文采用水中蒸馏法提取千层金精油，GC-MS分析和测定精油的主要成分和相对含量，摸索不同部位及不同月份千层金精油含量以及成分的变化规律，探讨千层金叶片精油含量及成分变化和外界生长温度及降水量季节变化的关系，以期为植物在不同月份和不同部位的精油变化规律提供一定的科学依据，为千层金精油的高效利用与开发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

千层金植物材料采自福建农林大学校内，于2017年1月下旬的晴天上午10∶00随机均匀采集千层金金黄色的新叶、绿色的老叶、枝条、茎干和根用于不同部位精油分析；于2017年1～12月的各个月份下旬的晴天上午10∶00随机均匀采集千层金黄色叶片用于不同月份精油含量和成分分析；采集时挑选没有病虫害，无机械损伤的千层金植物材料，洗净晾干之后备用；采样时记录外界环境温度和月平均降水量并整理于表1。

表1 采样时平均气温和降水量(2017年)

1.1.2 试剂与药品

色谱甲醇、无水乙醇、无水硫酸钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.1.3 主要仪器

LGJ-25C型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；EL204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；5810R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Clarus®680 + SQ8T型气相色谱-质谱联用仪(美国Perkin Elmer公司)；Elite-5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美国Elite公司)；中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 精油提取

采用水中蒸馏法提取精油。分别取不同部位(新叶、老叶、枝条、茎干、根)、不同月份50 g千层金原料，冷冻干燥后经粉碎机粉碎，过40目筛，以1∶7的比例加入350 g的双蒸水，置于圆底蒸馏瓶内，加热蒸馏千层金材料，2 h后收集精油，并用无水硫酸钠干燥后计算精油含量(精油质量/提取前植物材料质量×100%)，试验重复3次，取平均值。

1.2.2 精油成分分析

将精油用色谱甲醇稀释后采用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析精油成分，采用面积归一法计算各组分的相对含量，各组分的鉴定是通过与NIST11质谱数据库进行匹配对照解析，取碎片离子匹配度80%以上匹配数据(当有多个碎片离子匹配度超过 80% 时，选取最高值，同样匹配度时，选择匹配概率较高者，匹配度低于80%者定为未知) 。

气相色谱条件：色谱柱为Elite-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为99.999%氦气，载气压力82.74 kPa，流速1.0 ml/min；经色谱甲醇稀释后的精油进样1 uL，分流比1∶20，进样口温度250 ℃。升温程序为：柱初温50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升温至100 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升温至160 ℃，保持2 min；以50 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。

质谱条件：电离方式EI，电子能量70 ev，离子源温度230 ℃，质谱传输线温度250 ℃，扫描质量范围m/z 45～55，溶剂延迟1 min。

1.2.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 19统计分析软件处理实验数据，用ANOVA进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 不同部位千层金精油含量和成分分析

2.1.1 不同部位千层金精油含量分析

采用水中蒸馏法从千层金新叶、老叶与枝条、茎干和根五个不同部位提取精油，结果表明(表2)，新叶精油含量为0.268 %，老叶精油含量为0.282 %，而枝条、茎干和根的含量为0。

表2 千层金不同部位精油含量

注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.

2.1.2 千层金新叶和老叶精油成分分析

千层金新叶和老叶精油的GC-MS总离子流图见图1，成分分析结果见表3，千层金新叶精油主要含有24种成分，其中相对含量较高的为甲基丁香酚(86.36%)和肉桂酸甲酯(5.12%)，老叶精油主要含有26种成分，其中相对含量较高的同样是甲基丁香酚(85.45%)和肉桂酸甲酯(6.34%)。进一步分析发现，新叶精油和老叶精油的主要组成成分大体相同，但也存在差异，如在老叶精油中检测到(-)-柠檬烯、香叶酸甲酯、月桂烯，在新叶精油中并未被检测出来，而在新叶精油中发现α-荜澄茄油烯，在老叶精油中并未发现。其他精油成分在新叶和老叶精油中的相对含量偏低，在千层金叶片的发育过程中维持一个比较稳定的水平。

图1 新叶(A)和老叶(B)GC-MS离子流图Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of young leaves(A) and old leaves(B)

保留时间 Retention time(min)化学成分Chemical constituents相似度Similarity (%)相对含量 Relative content(%)新叶New leaves 老叶Old leaves10.2月桂烯 β-Myrcene90.5-0.01±0.0011.5α-水芹烯 α-Phellandrene94.20.53±0.01a0.61±0.01a12.1桉叶油醇Eucalyptol88.10.09±0.00a0.04±0.00b12.5(-)-柠檬烯 (-)-Limonene88.8-0.03±0.0014.7萜品油烯 Terpinolene93.40.28±0.00b0.35±0.01a15.5芳樟醇 Linalool95.40.55±0.01a0.21±0.00b17.6α-松油醇α-Terpineol92.10.16±0.00a0.04±0.00b

续表3(Continued Tab.3)

保留时间 Retention time(min)化学成分Chemical constituents相似度Similarity (%)相对含量 Relative content(%)新叶New leaves 老叶Old leaves19.84-烯丙基苯甲4-Allylanisole96.50.24±0.01b0.56±0.02a21.4香茅醛Citronellal94.70.04±0.00a0.02±0.00a21.5香茅醇Citronellol93.20.11±0.00a0.12±0.00a25.5香叶酸甲酯Methylgeranate89.8-0.33±0.0028.5肉桂酸甲酯Methyl cinnamate94.95.12±0.13b6.34±0.11a28.7甲基丁香酚Methyl eugenol96.886.36±0.78a85.45±0.69b29.1香橙烯Aromadendrene87.80.11±0.00a0.15±0.00a29.4别香橙烯Alloaromadendrene90.40.02±0.00b0.04±0.00a29.5异丁香烯Isocaryophyllene91.40.15±0.00b0.18±0.00a30.1蛇麻烯Humulene87.90.09±0.00a0.08±0.00a30.9异喇叭烯Isoledene90.30.12±0.00a0.08±0.00b31.1γ-榄香烯 γ-Elemene89.00.29±0.00a0.24±0.00b31.5β-胡椒烯 β-copaene93.20.06±0.00a0.05±0.00a31.6α-荜澄茄油烯 α-cubebene92.10.02±0.00-32.2δ-杜松烯 δ-Cadinene93.40.08±0.00a0.05±0.00b33.6榄香素Elemicin94.00.09±0.00a0.04±0.00b33.9α-依兰烯 α-ylangene84.30.02±0.00a0.03±0.00a35.9榧叶醇Torreyol88.20.05±0.00a0.05±0.00a36.2荜茄醇A-cadinol93.60.08±0.00a0.09±0.00a

注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.

2.2 不同月份千层金叶片精油的含量和成分分析

2.2.1 不同月份千层金叶片精油含量分析

由图2可知，千层金精油的含量在一年之中差异显著(P<0.05)，1月的精油含量最低，只有0.25%，与其它各月份的精油含量呈显著性差异，2-8月的精油含量逐渐升高，8月(1.10%)达到最大值，与其它各月份的精油含量呈显著性差异，随后开始缓慢下滑，至12月的精油含量只有0.60%。

图2 不同月份的千层金叶片精油含量(2017年)Fig.2 Contents of essential oil in M.bracteata leaves in different months of 2017注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicated significant differences at P<0.05 level.

精油为植物体内的次级代谢产物，其形成和积累与植物的生长发育过程密切相关。温度、降水等气候因子作为植物生长发育的重要影响因素，也必然影响其体内次级代谢产物的合成和积累，从而导致植物体内精油的含量和成分出现波动[14]。结合表1分析可知，不同月份千层金叶片精油含量与福州月平均气温和降水量的变化趋势大致相同。气温较高月份，精油含量也较高，随着气温降低，精油含量逐渐下降。这种变化趋势在其他植物精油提取中也有报道，如甜牛至(OriganumMajoranaL.)叶片精油的含量在一年之中的8月份达到其最大值，随后不断下降，直到2月份出现最低值后再慢慢升高[15]。在银灰菊(SantolinachamaecyparissusL.)中，精油含量也是在一年中温度较高的6月份最高，温度较低的12月份最低[16]。

在降水方面，1～6月，随着降水量不断增加，精油含量不断升高，8～12月，随着降水量不断减少，精油含量逐渐下降。这与朱雯琪的研究一致，在甜牛至中，降水量增大时，精油含量增多，降水量少的时候，精油含量刚好处于一年之中较低的水平[7]。张丹等的研究也发现，在干旱少水的时候，红松次级代谢反应受到了强烈的抑制，次级代谢产物含量显著下降，当复水的时候，大部分次级代谢产物含量在水分增加一段时间后慢慢升高[17]。由此可以初步得出，随着降水量的不断上升，千层金的生长发育受到促进，精油含量也不断的上升，反之减少。

2.2.2 不同月份千层金叶片精油成分变化分析

由表4可知，千层金叶片精油主要组成成分的相对含量在不同月份的变化趋势相对复杂。其中主要成分甲基丁香酚的含量在一年中差异显著(P<0.05)，在温度较高的7、8月份，甲基丁香酚含量也较高(9.10 mg/g和9.46 mg/g)，随后随着温度的降低，甲基丁香酚含量也逐渐降低，1月份达到最低值(2.10 mg/g)后再逐步回升(图3)。

研究表明，温度通过影响植物体内酶系统的活性和催化反应速度，从而影响植物体内精油成分的合成[14]。精油中的各种成分按照生物合成途径可分为萜烯类、苯丙烷类/苯环型和脂肪族化合物等三大类，千层金精油的主要成分甲基丁香酚属于苯丙烷类化合物，PAL、C4H是苯丙烷途径的关键酶，谭国飞等通过对鸭儿芹(Cryptotaeniajaponica)生长过程主要面临的4种不同温度(10、18、30、38 ℃)下C4H基因的表达检测发现，在较高温度(30 ℃和38 ℃)下，C4H基因的表达量增加，其中38 ℃条件下要明显高于30 ℃，说明高温条件下，苯丙烷途径相关基因响应更强，而低温条件下相关基因表达相对迟缓[18]。Liu等[19]通过对黄芩(scutellariabaicalensis)种子内次级代谢物质的研究表明，与室温(20 ℃)相比，低温条件下黄芩种子黄酮类化合物含量降低，PAL和C4H的活性也明显降低。杨慧芹等[20]研究也表明，成熟期的烟草(NicotianatobacumL.)在较高温度下酶活性较高，体内总酚含量也较高，荧光定量PCR发现，PAL与C4H-1基因的表达量也较高。

图3 不同月份的千层金精油中甲基丁香酚(2017年)的含量Fig.3 Relative contents of methyl eugenol in essential oil from M.bracteata leaves in different months of 2017注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicated significant differences at P<0.05 level．

保留时间Retention time(min)化学成分Chemical constituents相对含量Relative content(%)一月Jan二月Feb三月Mar四月Apr五月May六月June七月July八月Aug九月Spet十月Oct十一月Nov十二月Dec10.5月桂烯 β-Myrcene0.07±0.00a0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b0.01±0.00c0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b0.02±0.00b11.2α-水芹烯 α-Phellandrene0.65±0.01a0.17±0.01f0.01±0.00h0.02±0.00h0.05±0.00h0.04±0.00h0.12±0.01g0.07±0.00h0.24±0.01d0.41±0.01b0.21±0.01e0.32±0.01c12.2(-)-柠檬烯 (-)-Limonene0.17±0.01a0.05±0.00e0.01±0.00h0.01±0.00h0.02±0.00g0.03±0.00f0.03±0.00f0.03±0.00f0.06±0.00d0.09±0.00c0.10±0.00b0.01±0.00h12.4桉叶油醇Eucalyptol0.12±0.00a0.01±0.00g0.02±0.00fg0.02±0.00fg0.10±0.00b0.02±0.00fg0.04±0.00de0.03±0.00ef0.05±0.00d0.07±0.00c0.08±0.00c0.05±0.00d14.8萜品油烯Terpinolene0.75±0.02a0.21±0.01e0.03±0.00hi0.05±0.00hi0.06±0.00h0.04±0.00hi0.17±0.00f0.08±0.00g0.02±0.00hi0.56±0.02b0.25±0.00d0.28±0.00c15.6芳樟醇Linalool0.27±0.00g0.17±0.00h0.36±0.01f0.42±0.02d0.45±0.01c0.36±0.01f0.37±0.03f0.40±0.03e0.42±0.01d0.53±0.01a0.51±0.01b0.53±0.02a17.9异胡薄荷醇Cyclohexanol----0.03±0.00-------18.1香茅醛Citronellal0.05±0.00b0.03±0.00c0.02±0.00cd0.03±0.00c0.01±0.00d0.02±0.00cd0.02±0.00cd0.02±0.00cd0.03±0.00c0.05±0.00b0.18±0.00a0.01±0.00d20.0α-松油α-Terpineol0.49±0.01c0.22±0.01g0.22±0.00g0.32±0.01e0.19±0.00h0.20±0.00g0.29±0.01f0.29±0.01f0.47±0.04d0.55±0.03a0.51±0.02b0.47±0.01d

续表4(Continued Tab.4)

保留时间Retention time(min)化学成分Chemical constituents相对含量Relative content(%)一月Jan二月Feb三月Mar四月Apr五月May六月June七月July八月Aug九月Spet十月Oct十一月Nov十二月Dec20.14-烯丙基苯甲4-Allylanisole0.22±0.01a0.14±0.00e0.18±0.00c0.26±0.00a0.15±0.00de0.14±0.00e0.16±0.00d0.12±0.00f0.13±0.00f0.19±0.00c0.16±0.00d0.16±0.00d21.8香茅醇Citronellol0.11±0.00cd0.05±0.00g0.07±0.00f0.10±0.00de0.07±0.00f0.05±0.00g0.12±0.00bc0.13±0.00b0.11±0.00cd0.15±0.00a0.13±0.00b0.09±0.00e26.1香叶酸甲酯Methylgeranate0.03±0.00c0.05±0.00b0.02±0.00cd0.01±0.00d0.01±0.00d0.02±0.00cd0.02±0.00cd0.05±0.00b0.08±0.00a0.08±0.00a0.07±0.00a0.01±0.00d28.2肉桂酸甲酯Methyl cinnamate5.81±0.09f5.38±0.08g6.59±0.06d7.25±0.19c6.53±0.11d7.89±0.11a6.53±0.14d5.99±0.16e5.85±0.06ef6.44±0.11d7.50±0.11b7.46±0.12b28.8甲基丁香酚Methyl eugenol84.08±0.92f89.17±0.87a81.58±0.61g86.15±0.99bc87.63±1.95ab85.99±0.72bc86.74±0.25bc85.76±0.23bc85.19±0.74de84.77±0.47ef85.45±0.49cd87.19±0.22bc29.1香橙烯Aromadendrene0.13±0.00a0.03±0.00cd0.05±0.00b0.14±0.00a0.12±0.00a0.02±0.00de0.13±0.00a0.01±0.00e0.01±0.00e0.04±0.00bc0.02±0.00de0.01±0.00e29.5别香橙烯Alloaromadendrene0.02±0.00de0.01±0.00e0.03±0.00cd0.02±0.00de0.03±0.00cd0.05±0.00b0.09±0.00a0.04±0.00bc0.05±0.00b0.02±0.00de0.05±0.00b0.01±0.00e29.7异丁香烯IsoCaryophyllene0.09±0.00f0.08±0.00f0.11±0.00e0.12±0.00e0.16±0.00d0.18±0.00c0.22±0.00b0.24±0.00a0.18±0.00c0.15±0.00d0.11±0.00e0.15±0.00d30.4蛇麻烯Humulene0.10±0.00d0.06±0.00f0.03±0.00g0.08±0.00e0.02±0.00g0.06±0.00f0.08±0.00e0.16±0.00b0.09±0.00de0.18±0.00a0.14±0.00c0.06±0.00f31.2β-胡椒烯 β-Copaene0.08±0.00j0.19±0.00f0.21±0.00e0.28±0.00d0.57±0.03c0.77±0.01a0.04±0.00j0.21±0.02e0.66±0.02b0.17±0.00g0.15±0.00h0.13±0.00i31.3α-荜澄茄油烯α-Cubebene--0.35±0.01c---0.64±0.04b1.28±0.01a----31.5异喇叭烯Isoledene0.02±0.00e0.01±0.00f0.01±0.00f0.02±0.00e0.08±0.00b0.10±0.00a0.01±0.00f0.08±0.00b0.03±0.00d0.05±0.00c0.01±0.00f0.01±0.00f31.6γ-榄香烯 γ-Elemene0.22±0.00f0.19±0.00g0.27±0.00e0.28±0.00de0.27±0.00e0.28±0.01de0.31±0.01b0.36±0.01a0.31±0.00b0.30±0.01bc0.29±0.00cd0.29±0.00cd32.3δ-杜松烯 δ-Cadinene0.03±0.00e0.01±0.00f0.01±0.00f0.01±0.00f0.03±0.00e0.03±0.00e0.15±0.00b0.20±0.00a0.14±0.00b0.08±0.00c0.06±0.00d0.01±0.00f33.1榄香素Elemicin0.05±0.00de0.06±0.00cd0.01±0.00f0.04±0.00e0.04±0.00e0.05±0.00de0.04±0.00e0.05±0.00de0.09±0.00a0.07±0.00bc0.08±0.00ab0.01±0.00f34.3α-依兰烯 α-Ylangene0.03±0.00bc0.01±0.00d0.03±0.00bc0.10±0.00d0.04±0.00b0.02±0.00cd0.03±0.00bc0.08±0.00a0.03±0.00bc0.04±0.00b0.02±0.00cd0.03±0.00bc35.8榧叶醇Torreyol0.03±0.00a0.03±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a0.04±0.00a36.0荜茄醇 .tau..Cadinol0.09±0.00h0.11±0.00g0.07±0.00hi0.08±0.00hi0.25±0.00b0.19±0.00d0.21±0.00c0.32±0.01a0.26±0.00b0.19±0.00d0.13±0.00f0.16±0.00e38.92-十六烷醇2-Hexadecanol--0.19±0.00---------

注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.

3 结论

本文通过水中蒸馏法对2017年1～12月下旬采摘的千层金进行精油的提取，然后利用GC-MS联用仪对其成分进行分析后发现：(1)千层金不同部位的精油含量不同，其中，老叶含量最高(0.282%)，新叶(0.268%)次之，而枝条、茎干和根中不含精油，千层金叶片是千层金精油提取的最主要部分。新叶和老叶的主要成分大体相同，其中，相对含量最高的为甲基丁香酚，高达85%以上;(2)福州地区精油含量1、2月份最低，7、8月份最高，这种变化可能与气温和降水量有关。这是由于精油中各种成分的合成、积累是植物体内氧化、聚合、失水、环化及酯化等多种生理生化反应的综合结果，气温和降水量作为影响植物生长发育的重要因素，必然影响其体内的生理生化反应，同时，温度的升高可以使PAL、C4H等基因的表达上调，酶活性增强，从而导致下游甲基丁香酚的合成加强，导致千层金精油不同月份的含量出现显著的变化。