基于高效液相指纹图谱和化学计量法的防风药材及其伪品的鉴别

张 丹，木盼盼，郭 梅，郑开颜，李国川，侯芳洁，郭 龙*，郑玉光*

1河北中医学院药学院；2河北中医学院实验中心，石家庄 050200

防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效，主要用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风等症[1]。近年来防风需求量日益增大，而野生药材资源日益减少，难以满足市场需要，栽培防风逐渐成为市场的主流。目前，防风药材品质差异较大，主要体现在规范化种植防风所占面积较小以及地方习用品的混入，造成主流市场真伪混杂、质量良莠不齐。现代研究表明，防风含有色原酮类、香豆素类、有机酸、多糖类、聚炔类、甾醇类等多种化学成分，具有解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗惊厥等作用[2,3]。其中所含的色原酮类成分，是其发挥解热、镇痛、镇静、抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[4-8]。可见，对于防风药材进行质量评价可从其所含色原酮类成分着手，测定色原酮类成分含量，以初步对防风药材的质量及真伪进行评价。因此，本实验以其中色原酮类成为作为质量评价的指标，借助高效液相色谱法对防风药材及其伪品进行区分，以期完善防风的质量评价体系，并建立基于HPLC法的防风药材的真伪鉴别手段。

1 材料

1.1 试验设备

岛津LC-20 A高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；Shimadzu inertsil ODS-2高效液相色谱柱 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；BSA224S-CW电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；KQ2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试验试剂

乙腈(色谱纯，Fisher Scientific Co.Ltd.)，甲醇(色谱纯，Fisher Scientific Co.Ltd.)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；升麻素苷(批号PRF7040523，纯度 > 98% )，升麻素(批号PRF7090123，纯度>98%)，5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号PRF7083021，纯度>98%)，亥茅酚苷(批号PRF7083022，纯度>98%)均购自于成都普瑞法科技开发有限公司。

1.3 实验药材

27批药材购买于各地药材市场，经河北中医学院生药学教研室郑玉光教授鉴定为防风S.adivaricata(Turcz.)Schischk.(关防风、口防风)、葛缕子CarumcarviL.(小防风)、竹叶西风芹SeselimaireiWolff.(云防风)、宽萼岩风Libanotislaticalycina(水防风)的干燥根，凭证标本保存于河北中医学院生药学研究室。具体见表1。

表1 防风样品详细信息

续表1(Continued Tab.1)

编号No.产地Growing area品种Cultivated varietiesS22甘肃岷县Min Country,Gansu小防风XiaofangfengS23甘肃定西Dingxi,Gansu小防风XiaofangfengS24甘肃甘南Gannan,Gansu小防风XiaofangfengS25云南大理Dali,Yunnan云防风YunfangfengS26云南大理Dali,Yunnan云防风YunfangfengS27云南楚雄Chuxiong,Yunnan云防风Yunfangfeng

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Inertsil ODS-2 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；流动相乙腈 (A)-水溶液 (B)梯度洗脱，洗脱程序为(0～20 min，15%～25% A，20～30 min，25%～50% A，30～40 min，50%～50% A)，流速1 mL/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；按升麻素苷计算理论塔板数应不低于2 000。对照品及样品(S1)图谱见图1。

图1 防风药材(S1)的HPLC图谱Fig.1 HPLC Chromatogram of Saposhnikoviae Radix注：A.对照品；B.样品(S1)；1.升麻素苷；2.升麻素；3.5-O-甲基维斯阿米醇苷；4.亥茅酚苷。Note:A.Reference substance;B.Sample (S1)；1.Prim-O-glucosylcimifugin；2.Cimifugin；3.4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol；4.Sec-O-glucosylhamaudol.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品适量，用甲醇溶解配制升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷的对照品混合溶液，浓度分别为0.080、0.018 4、0.081 6、0.040 8 mg/mL。

2.3 供试品溶液的制备

防风药材粉碎过40目筛，干燥至恒重，精密称取样品粉末约l g(详见表3)，放在具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，称重，水浴回流提取2 h，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，以0.22 μm滤膜过滤。取续滤液，即得。

3 结果

3.1 防风药材4种成分含量测定

3.1.1 线性关系考察

将混合对照品溶液用甲醇稀释成一系列梯度浓度的溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析。以对照品的峰面积为纵坐标，以样品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程和线性范围，结果见表2，各成分在各自浓度范围内线性关系良好。

3.1.2 精密度试验

将混合对照品溶液，按照“2.1项”下色谱条件重复进样6次，计算4种成分的RSD(n=6)，考察精密度。5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷的RSD分别为0.97%、0.59%、1.14%、1.64%，表明仪器精密度良好。

表2 防风4种成分的标准曲线、线性范围

3.1.3 稳定性试验

精密吸取同一防风(S4)供试品溶液，分别在供试品溶液制备后第0、2、4、8、12、24、48 h进样，以3号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD<3.0%，相对峰面积的RSD<3.0%，表明防风供试品溶液在制备后48 h内稳定。

3.1.4 重复性试验

取同一批防风(S4)粉末约1 g，平行6份(取样量分别为1.001 5、1.001 1、1.001 2、1.001 1、0.999 8、1.000 9 g)，精密称定，按2.3项下方法处理，得供试品溶液，按照“2.1项”下色谱条件分别进样，以3号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD都小于3.0%，相对峰面积的RSD都小于3.0%，表明该方法的重复性良好。

3.1.5 加样回收率试验

取已知含量(S4)的防风药材样品约0.5 g，平行6份，精密称定(取样量分别为0.500 5 、0.501 1、0.499 8、0.501 2 、0.500 1、0.500 9 g)，分别加入4种对照品适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，2.1项下色谱条件进行进样分析，计算4种成分的加样回收率。升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷，亥茅酚苷的平均回收率分别为99.8%、97.9%、102.4%、101.5%；RSD值分别为2.3%、1.9%、1.2%、1.5%。

3.1.6 样品的含量测定

按照2.3项下方法制备27批供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别测定27批样品中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷，亥茅酚苷的含量，结果见表3。

表3 27批防风样品中4种成分的含量

续表3(Continued Tab.3)

编号No.取样量Weight(g)升麻素苷Prim-O-glucosylcimifugin(%)升麻素Cimifugin(%)5-O-甲基维斯阿米醇苷4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)亥茅酚苷Sec-O-glucosylhamaudol(%)升麻素苷+5-O-甲基维斯阿米醇苷Prim-O-glucosylcimifugin+4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)S191.00120.0214----S201.0009-----S210.99790.0479----S220.9995-----S231.0015-----S241.00430.01620.0040---S251.00050.05800.0085---S261.00020.08250.0107---S271.0019-0.0041---

注：-表示未检测到。

Note:-Indicated no detection.

由含量测定结果可知，小防风和云防风均无法检测到《中国药典》2015版规定的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷；但河南水防风的含量测定的指标满足药典的规定，即升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.24%[1]，通过对4个成分的定量还发现，水防风中升麻素的含量要高于正品防风，亥茅酚苷的含量则低于正品防风，具体的规律需要进一步的实验证明。因此，通过HPLC法可将小防风和云防风鉴别为伪品，但水防风满足药典标准，在实际应用中要注意鉴别。可见通过HPLC的含量测定方法在防风鉴别上具有一定的局限性。

3.2 防风的指纹图谱研究

鉴于HPLC法在防风真伪鉴别上的局限性，为了更加突出不同来源防风的差异，本实验继续借助HPLC指纹图谱的方法区分真伪防风，以期更加全面评价不同来源的防风药材及其伪品。

3.2.1 精密度试验

精密吸取同一防风样品(S4)供试品溶液，连续同一条件进样6次，以1号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD<3.0%，相对峰面积的RSD<3.0%。

3.2.2 稳定性试验

精密吸取同一防风(S4)供试品溶液，分别在供试品溶液制备后第0、2、6、8、12、24、48 h进样，以1号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD<3.0%，相对峰面积的RSD<3.0%，实验结果证明供试品溶液在制备后48 h内稳定。

3.2.3 重复性试验

取同一批防风( S4)粉末约1 g，平行6份，精密称定，按2.3项下方法处理，得供试品溶液，分别进样，记录特征图谱，以1号峰为参照峰，各特征峰保留时间的RSD<3.0%，相对峰面积的RSD<3.0%，表明该方法的重复性良好。

图2 27批防风药材HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of 27 batches about Saposhnikoviae Radix

3.2.4 指纹图谱相似度分析

27批防风样品的色谱图见图2，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版”对所得色谱图进行数据处理，以S1作为参比图谱，采用中位数法，在时间窗宽度为0.10时，确定共有峰9个，生成对照指纹图谱见图3。6个不同品种的防风药材指纹图谱与对照图谱比对，各样品之间的相似度为0.087～0.997之间，相似度结果见表4。由结果可知防风与其伪品之间的相似度较差，突出表现为小防风、云防风、水防风与正品防风的区别性；而正品防风之间则具有较好的相似度。因此，所建立的防风药材的指纹图谱可用于防风药材的鉴别。

3.3 结合化学计量法的防风药材的真伪鉴别

为了验证已建立的防风的质量评价方法，同时进一步说明不同等级的防风药材的内在品质差异，本研究运用系统聚类分析和主成分分析法对数据进行分析，确保结果可靠准确。

图3 防风药材的对照指纹图谱Fig.3 Reference fingerprint of Saposhnikoviae Radix

No.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityS10.983S100.870S190.286S20.986S110.997S200.087S30.982S120.976S210.144S40.930S130.974S220.233S50.993S140.982S230.151S60.982S150.884S240.400S70.988S160.948S250.703S80.980S170.854S260.810S90.893S180.786S270.266

3.3.1 系统聚类分析

利用系统聚类分析可将具有相似性的样品归为一类的特点。用SPSS 22.0软件对本实验27批样品进行聚类分析，将4个色原酮成分的百分含量作为原变量，所有数据经过标准化处理，聚类方法采用组间连接法及平方欧式距离法，结果见图4。由图4

图4 防风药材聚类分析树状图Fig.4 Hierarchical cluster analysis of Saposhnikoviae Radix

可知，防风药材及其伪品可被分为2类，即关防风和口防风一类，栽培防风和伪品一类。

3.3.2 主成分分析

在聚类分析的基础上，采用SIMCA 13.0软件对原变量进行主成分分析。由主成分分析结果可知，前两个主成分累积贡献率为94.14%，其中第一主成分贡献率为74.14%，第二主成分贡献率为19.99%，相关结果如图所示(见图5)。主成分分析结果与聚类分析结果基本一致，即可将防风药材基本分为正品防风和伪品防风，可见对防风中4个成分的定量分析，可将防风药材及其伪品区别开来，所建立的分析防风可用于防风药材的真伪鉴别。

图5 防风药材主成分分析图Fig.5 PCA of Saposhnikoviae Radix

成份Composition初始特征值Initial eigenvalue提取平方和载入Extract square sum loading合计Total方差贡献率Variance contribution rate(%)累积方差贡献率Cumulative variance contribution rate(%)合计Total方差贡献率Variance contribution rate(%)累积方差贡献率Cumulative variance contribution rate(%)12.56674.14474.1442.56674.14474.14421.20019.99394.1371.20019.99394.13730.1463.63897.77540.0892.225100.000

根据聚类分析和主成分分析结果，结合含量测定的结果可将正品防风和伪品防风进行分类，所建立的定量分析方法可用于正品防风药材的区分鉴别与质量控制。

4 讨论

防风中含有色原酮类、香豆素类、挥发油类和多糖类等多种成分类型，以色原酮类为其主要活性成分[2]。本研究采用高效液相色谱法测定了其中的4个色原酮类成分并建立了高效液相指纹图谱，结果表明正品防风各批次之间的相似度均大于0.870，与伪品的相似度比较P<0.01，说明正品防风与伪品防风之间具有极显著性差异，所建立的含量测定方法可用于防风药材的真伪鉴别。

为了进一步对防风药材及其伪品进行区分，借助系统聚类分析和主成分分析对含量测定的结果进行分析。结果说明，基于含量测定的结果可以将防风药材及其伪品区分开来。所建立的基于含量测定和化学计量学结合的方法可用于防风药材及其伪品的鉴别。

以《中国药典》2015版的标准，河南产水防风的含量符合药典要求[1]，而本实验通过测定其中的4个色原酮类成分并建立化学指纹图谱的方法可以将其区分开，说明药典的含量测定指标在鉴定防风药材的真伪上具有一定的局限性。因此，本实验所建立的方法既能比较全面、综合地比较防风谱图之间的相似关系，又能比较不同产地的防风谱图之间的差异，为防风药材的真伪鉴别提供较好的依据。