烟叶中一个新的氨基糖苷化合物

杨彩艳,元辉雄,潘乔丹,黄元河,杨文沛,黄祖良

1右江民族医学院药学院，百色，533000；2广西高校右江流域地道中药材 (民族医药) 研究重点实验室，百色 533000；3 右江民族医学院附属医院，百色，533000

茄科烟草属植物包含普通烟草、黄花烟草和碧冬烟草三个亚属共约67个品种，其中除普通烟草(NicotianatabacumL.)和黄花烟草(NicotianarusticaL.)可以直接栽培利用外其它均为野生种；野生烟形态各异、用途不一、无直接商业价值，但它们具备较为突出的抗病、抗虫、抗逆性基因，这些基因转移到栽培品种得到如Kentucky 56、Burley 21、K358等多种抗病毒、抗虫害烟草种；因此作为重要经济作物的烟草(N.tabacum)因其不同品种在育种过程中采用杂交、转移野生烟的品种和基因不同导致其香味、化学成分、活性差别较大[1-3]。前人对烟叶非挥发性化学成分研究发现包括黄酮、生物碱、萜类、香豆素、酚类化合物等大约两百个化合物，我们之前从云南采集的烟叶中分离到6个降倍半萜、2个倍半萜和1个生物碱共9个新化合物[4-10]。前人关于烟草及其化合物药理活性研究表明其具有如抗AD (阿尔茨海默病)、抗癌、抗菌、降血糖和抗炎等多种生物活性[5,9,11-13]。为研究环境、气候、地理位置等对植物化学成分及生物活性影响，为扩大烟草的利用价值提供科学理论和实验依据，我们对世界长寿之乡广西乐业县烟叶的化学成分及生物活性进行系统研究，结果发现一个新的、天然产物中结构不常见的化合物烟草羟基氨基糖苷(1)。通过广泛的核磁波谱数据分析确定化合物1的结构为3-O-二十六酰基-1-O-(6-去氧-6-羟基氨基-α-D-葡萄糖基)-甘油[3-O-heptacosanoyl-1-O-(6-deoxy-6- hydroxyamino-α-D-glucosyl)-glycerol]。在化合物1对胃癌MGC-803细胞的生物活性实验中，1没有表现明显的生物活性。

1 实验

1.1 仪器和材料

旋光使用Jascomodel 1020 polarimeter 旋光仪(Horiba,Tokyo,Japan)测定。高分辨质谱(HRESIMS)采用LCMS-IT-TOF质谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；红外光谱(IR) 经KBr压片后用Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪(Bio-Rad,Hercules,California,USA)测定；核磁共振谱采用Brucker DRX-500和Bruker Avance III-600型超导核磁共振仪(Bruker,Bremerhaven,Germany)测定。柱色谱的材料为硅胶(200～300 目,青岛美高集团有限公司,青岛,中国)、C18(Merck,Darmstadt,Germany)、Sephadex LH-20(Amersham Bioscience,Sweden)和MCI CHP 20P(Mitsubishi Chemical Institute,Tokyo,Japan).HP90 CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司,上海,中国)、DMIL LED 倒置式生物显微镜(Leica,Solms,Germany)和MK3 酶标仪(上海塞默飞世尔仪器有限公司,上海,中国)用于活性测试。

烟叶采自广西壮族自治区乐业县，由右江民族医学院的黄元河副教授鉴定为N.tabacumLinn。标本(No.2015-06-06)存放于右江民族医学院药学院杨彩艳老师研究组。

1.2 提取和分离

干烟叶(2.6 kg)依次使用EtOH-H2O(90∶10,50∶50,v/v)浸提3次，每次3天，最后用沸水提取0.5 h，提取液混合浓缩后进一步使用 H2O和EtOAc萃取。把EtOAc 层萃取液回收后获得EtOAc部分浸膏(498 g)。EtOAc部分浸膏经过硅胶柱色谱(3.0 kg,20.0×100 cm) 使用CHCl3-MeOH-H2O(100∶0∶0,95∶5∶0,90∶10∶0,80∶20∶2)作为流动相分离得到 Frs.1-8.Fr.7 (38 g)使用 MCI CHP 20P 柱层析(310 g,4.0×40 cm)以 MeOH-H2O(20∶80,40∶60,60∶40,80∶20,100∶0)洗脱产生Frs.7.1-7.5。Fr.7.2(12.9 g)通过硅胶柱色谱(300 g,6.0×50 cm)以 EtOAc-MeOH-H2O(80∶20∶2)为流动相分离提供Frs.7.2.1～7.2.4。Fr.7.2.4(5.5 g)经过硅胶柱色谱CC(160 g,5.0×50 cm)以EtOAc-MeOH-HCOOH-H2O(85∶15∶1.5∶1.5)为流动相洗脱获得 Frs.7.2.4.1-7.2.4.6。Fr.7.2.4.5(0.94 g)先使用硅胶柱层析 CC(30 g,1.8×50 cm)以 CHCl3-MeOH-HCOOH(80∶20∶2)为流动相分离，进一步使用Sephadex LH 20(50 g,1.4×150 cm)纯化获得化合物1(5 mg)。

1.3 活性测试

化合物1在胃癌MGC-803细胞上的活性测试参考我们之前报道的方法进行[14]。 把细胞接种于96-孔培养板并保持5000 个细胞/mL的密度于37 ℃和5 % CO2条件下培养1天。在测试组和空白组中都以新鲜溶液代替培养液在37 ℃、饱和湿度和 5% CO2条件下培养2天。然后在孔中加入20 μL MTT 试剂(5 mg/mL)并在 37 ℃ 下培养 4 h。最后使用酶标仪读出各孔的光密度值。

2 结果和讨论

2.1 结构鉴定

烟草氨基糖苷(1)，(+) HR-ESI-MSm/z648.4097 [M+H]+表明其分子式为C35H69O9N，不饱和度为2。IR表明其含有羟基和羰基(3417,1737 cm-1)；1H 和13C NMR 数据(表 1) 表明其含有一个正构长链酰基[δH2.32 (m),1.62 (m),1.34 (m),1.28 (m),1.26 (m) 和 0.88 (t,J= 7.0 Hz);δC175.1,35.1,33.1,30.1-31.2,26.0,23.8 和 14.6]、糖基 [δH4.74 (d,J= 3.6 Hz),3.35 (dd,J= 14.0,2.3 Hz),2.90 (dd,J= 14.0,9.3 Hz);δC100.0,73.4,75.1,75.2,70.2和54.5] 和一个甘油基[δH4.07 (dd,J= 10.7,5.3 Hz),3.54 (dd,J= 10.7,6.3 Hz),5.28 (m),4.48 (dd,J= 12.2,2.7 Hz) 和 4.20 (dd,J= 12.2,6.8 Hz);δC67.1,71.6 and 64.0]。此外，糖基的1H和13C NMR数据与methyl 6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucupyranoside 非常相似推测糖基为6-去氧-6-羟基氨基-α-D-葡萄糖基(6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucosyl)[15]。糖基中H-1′ 和H-2′之间较小的1H-1H耦合常数(3.6 Hz)，13C NMR中C-6′化学位移从α-D-葡萄糖基中60.9 向高场移动到化合物1中 54.5，以及ROESY中H-1′ (δH4.74)/ H-2′ (3.40)/H-4′ (3.08)/H-6′a(2.90)和 H-3′(3.60)/H-5′(4.01)关键的相关关系(见图2)证实了以上的推测[16]。HMBC中H-1 (4.07)/C-1′ (100.0),H-3 (4.20)/C-1″ (175.1)相关关系(见图2)表明糖基和酰基分别连接在甘油基团的C-1和C-3上。最后根据分子式可推测正构长链酰基为二十六酰基。至此化合物1的结构鉴定为3-O-二十六酰基-1-O-(6-去氧-6-羟基氨基-α-D-葡萄糖基)-甘油(3-O-heptacosanoyl -1-O-(6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucosyl)-glycerol)，为一新化合物，命名为烟草羟基氨基糖苷。

表1 化合物1在甲醇中的1H 和 13C NMR数据 (δ 为ppm,J 为 Hz)

图1 化合物1的结构Fig.1 The structure of compound 1

图2 化合物1关键的1H-1H COSY、HMBC和ROESY关系Fig.2 The key 1H-1H COSY,HMBC and ROESY correlations of compound 1

化合物1白色粉末。[α]24 D:- 8.5 (c 0.08,MeOH);IR (KBr)vmax3417,1737,1626,1464,1384,1149,1118 cm-1;1H (500 MHz) 和13C (125 MHz) NMR 数据见表 1;HR-ESI-MSm/z648.4097 (计算值为 C35H69O9N,648.5045)。

2.2 活性测试结果

化合物1在胃癌MGC-803 细胞系上体外抗癌活性通过MTT法进行评价，但在浓度为50 μg/mL时其对MGC-803 细胞的抑制率为18%，没有表现比较明显抗胃癌细胞增值活性。

3 结论

据我们所知，烟草羟基氨基糖苷是首次从天然资源中分离的一个新的、不常见的天然产物，它丰富了天然产物的结构和类型，这将为进一步研究天然资源尤其是烟草植物化学成分提供有价值的信息；此外，氨基糖苷类是古老的抗微生物药物之一，具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌及抗原虫等抗菌活性，是治疗革兰阴性菌和结核杆菌感染的首选药物之一[17,18]。因此，今后进一步分离纯化烟草化学成分或对烟草羟基氨基糖类化合物进行合成或半合成可以为研究此类化合物生物活性研究提供物质基础，也可以解决本论文中尚未解决的C-2原子绝对构型问题。