桂枝茯苓汤对子宫内膜癌的药效及其机制初步探讨

何凤仪，王 弋，罗艳华，金海燕，邝少松*

(1. 广州医科大学附属第二医院，广州 510260；2. 广东省医学实验动物中心，广东 佛山 528248)

桂枝茯苓丸出自东汉医学家张仲景《金匮要略·妇人妊娠病篇》，是妇科常用方剂。具有活血、化瘀、消癥之功，在临床上主要用于治疗妇女瘀血阻络所致癥块、经闭、子宫肌瘤、慢性盆腔炎包块、痛经、子宫内膜异位症等症状[1-2]。现代药理学研究显示，桂枝茯苓丸所含桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓 5 味中药中的很多活性成分均具有免疫调节的作用[3-5]。本文通过研究桂枝茯苓汤对HEC-1-B子宫内膜癌荷瘤裸鼠的影响，并为进一步的研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

4 ～ 5周龄，雌性，BALB/c裸小鼠，30只，实验开始体重：13.3 ～ 14.7 g，SPF级，购于广东省医学实验动物中心[SCXK (粤) 2013-0002]，动物质量合格证号：44007200044449。实验地点为广东省医学实验动物中心比较医学实验室[SYXK (粤) 2013-0002]，实验证明编号：00179376。福利伦理审查证号：B201709-18，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 细胞株

HEC-1-B人子宫内膜癌细胞，提供单位：中国科学院细胞库。细胞培养在广东省医学实验动物中心细胞室，培养条件：37℃，5% CO2，选用MEM培养基，添加10%胎牛血清，1%双抗。

1.2 主要试剂与仪器

药物与配制：桂枝茯苓汤：由广东一方制药厂生产的中药浓缩提取物中药免煎配方颗粒制成，组方：桂枝颗粒：1.25 g、茯苓颗粒1.0 g、赤芍颗粒3.0 g、丹皮颗粒1.8 g、桃仁颗粒3.0 g、甘草颗粒1.67 g。试验前称取中药配方颗粒加开水使其充分溶解，配制成所需浓度的桂枝茯苓汤。卡铂注射液：齐鲁制药(海南)有限公司生产，生产批号：BB2J7009，给药前用5%葡萄糖注射液稀释至所需浓度。

主要试剂：MEM培养液，批号：8117148，Gibco；胎牛血清，批号：42F5353 K，Gibco；0.25% Trypsin-EDTA，批号：75030101100，Genview；青霉素/链霉素，批号：69230101100，Genview；PBS磷酸盐缓冲剂，批号：60A1001200，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；一抗Caspase-3抗体，货号：GB11009，Servicebio；一抗Bcl-2抗体，货号：GB12008，Servicebio；二抗HRP标记山羊抗小鼠IgG，货号：GB23301，Servicebio；组化试剂盒DAB显色剂，货号：G1211，Servicebio；二甲苯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸(PH6.0)抗原修复液，货号：G1202，Servicebio；3%双氧水，货号：G0115，Servicebio；BSA，货号：G5001，Servicebio；苏木素染液，货号：G1004，Servicebio；苏木素分化液，货号：G1309，Servicebio；苏木素返蓝液，货号：G1340，Servicebio；中性树胶，货号：G1403，Servicebio。

主要仪器：游标卡尺，上海台海工量具有限公司；电子天平，德国Sartorius，天平感量0.1 mg；脱水机，武汉俊杰电子有限公司，型号：JJ-12 J；包埋机，武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5；病理切片机，上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016；组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KD-P；烤箱，上海慧泰仪器制造有限公司，型号：DHG-9140 A；脱色摇床，Servicebio，型号：TSY-B；荧光显微镜，Olympus，型号：BX41。

1.3 实验方法

1.3.1 子宫内膜癌皮下模型的建立

裸鼠检疫合格后纳入试验，HEC-1-B细胞培养至对数生长期，胰酶消化，台盼兰染色计数，用 PBS配成浓度为2×l07个/mL的细胞悬液，于30只裸鼠左侧肩背部注细胞悬液，每次注射前需混匀细胞悬液(每只裸鼠200 μL，共计4×106细胞)。待肿瘤体积生长至约100 mm3～200 mm3时，选取肿瘤体积较均匀的18只模型动物随机分为3组：模型对照组、卡铂注射液组、桂枝茯苓汤组，6只/组。淘汰裸鼠采用颈椎脱臼处死。

1.3.2 给药方法

模型对照组动物每天按0.2 mL/10 g体重灌胃给予去离子水，桂枝茯苓汤组动物每天按0.2 mL/10 g体重灌胃给予0.12 g/mL桂枝茯苓汤，每天1次，连续给药21 d；卡铂注射液组动物每天按0.1 mL/10 g体重腹腔注射给予2 mg/mL卡铂注射液，每天1次，连续给药5 d。

1.3.3 动物观察

每天观察动物的饮食情况、精神状态、活跃程度、粪便情况，并进行记录，每周称量动物体重2次。

1.3.4 肿瘤体积及脾系数

从肿瘤成模后至实验结束，每周测量2次肿瘤长短径，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积按公式： V=1/2ab2测量计算，a、b分别表示长和宽；相对肿瘤增殖率T/C(%)：针对每一种人癌异体移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公式如下：T/C%=TRTV / CRTV×100%。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：模型对照组RTV)。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为： RTV=Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d1)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。实验结束后，取裸鼠脾脏称重，以脾重比体重计算脾系数。

1.3.5 免疫组化

(1)石蜡切片脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min,二甲苯III 15 min,无水乙醇Ⅰ5 min,无水乙醇Ⅱ5 min,85%酒精5 min,75%酒精5 min,蒸馏水洗。

(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10 min至沸，停火5 min保温再转中低火5 min，停火2 min保温再转中低火5 min此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。

(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。

(4)血清封闭:在组化圈内滴加3% BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min。

(5)一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。

(6)二抗：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min。

(7)DAB显色：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

(8)复染细胞核：苏木素复染3 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

(9)脱水封片：将切片依次放入75%酒精5 min,85%酒精5 min,无水乙醇Ⅰ5 min,无水乙醇Ⅱ5 min,二甲苯Ⅰ5 min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床观察

给药期间，动物精神状态良好，饮食情况、精神状态、活跃程度、粪便情况均未见异常，模型对照组及桂枝茯苓汤组体重正常增加，卡铂注射液组体重下降。见表1。

表1 桂枝茯苓汤对HEC-1-B子宫内膜癌荷瘤裸鼠体重的影响

表2 桂枝茯苓汤对HEC-1-B子宫内膜癌荷瘤裸鼠肿瘤的影响

注：与模型对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the model group,*P<0.05.

2.2 肿瘤体积

根据每周肿瘤测量情况，绘制肿瘤生长曲线图。卡铂注射液组肿瘤相对增值率为58.2%；桂枝茯苓汤组肿瘤相对增值率为67.3%；与模型对照组比较，卡铂注射液组和桂枝茯苓汤组肿瘤体积均显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3 脾系数

与模型对照组比较，桂枝茯苓汤组脾系数略有增加，卡铂注射液组脾系数显著降低(P<0.01)，见表3。

2.4 免疫组化结果

2.4.1 Bcl-2表达

模型对照组颜色较深，表明肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达较多，桂枝茯苓汤组和卡铂组肿瘤组颜色较浅，表明肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达较少。见图1。

2.4.2 Caspase-3表达

模型对照组颜色较浅，表明肿瘤组织中caspase-3表达较少，桂枝茯苓汤组和卡铂组肿瘤组颜色较深，表明肿瘤组织中caspase-3表达较多。见图2。

3 讨论

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一种上皮性恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，并且近年来在世界范围内的发病率呈上升趋势[6]。早期患者以手术治疗为主，晚期或复发患者需以化疗提高治疗效果[7-8]，然而反复化疗在抗癌的同时也带来了严重的毒副作用，降低机体免疫力，严重影响患者的生活质量[9-12]。因此，抗癌效果好，且毒副作用低的治疗药物一直是研究热点。

在本实验研究中，卡铂注射液组相对肿瘤增值率为58.2%，桂枝茯苓汤组相对肿瘤增值率为67.3%，两组肿瘤体积较模型对照组显著减小，表明桂枝茯苓汤及卡铂注射液对子宫内膜癌具有抑制的效果；同时桂枝茯苓汤组动物体重正常增加，卡铂注射液组动物体重有所下降，表明桂枝茯苓汤对裸鼠未见明显毒性反应；脾脏称量结果表明，卡铂注射液组脾脏重量及脾系数较模型对照组显著降低，桂枝茯苓汤组脾脏重量及脾系数较模型对照组未见显著变化，表明桂枝茯苓汤未见免疫抑制效果。

表3 桂枝茯苓汤对HEC-1-B子宫内膜癌荷瘤裸鼠脾系数的影响

注：与模型对照组比较，**P<0.01。

Note. Compared with the model group,**P<0.01.

哺乳动物细胞依赖 caspase 引发凋亡主要有3 条途径[13]：死亡受体途径(TNF/TNFR，Fas/Fasl)、线粒体途径和内质网途径[14]。其中caspase-3是引起细胞凋亡的因子，本实验中免疫组化结果表明桂枝茯苓汤组肿瘤组织caspase-3表达高于模型对照组肿瘤组织，表明桂枝茯苓汤具有促进子宫内膜癌凋亡的功效。同时，Bcl-2 作为凋亡蛋白Bcl-2 家族成员，在无外界凋亡刺激时，具有抑制凋亡作用，当 Bcl-2 高表达时，细胞凋亡被抑制[15-16]。本实验得到的模型对组肿瘤组织中 Bcl-2 蛋白表达水平较桂枝茯苓汤组较高，表明Bcl-2 蛋白表达水平的变化可能是桂枝茯苓汤可以抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡的分子机制。本研究将进一步从细胞、分子水平来阐述桂枝茯苓汤的作用机制，为其临床应用提供更充足的依据。