缬沙坦灌胃糖尿病肾病小鼠肠道菌群多样性观察

许祯，倪雅丽，肖曼，杜冠魁

(1 海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199;2 海南医学院药学院;3 海南医学院生物化学与分子生物学教研室)

糖尿病发病率呈世界性的逐年上升趋势[1]。目前，糖尿病已成为发达国家继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，糖尿病可导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官的慢性进行性病变，给社会带来巨大的经济负担[1]。糖尿病肾病(DN)是严重的糖尿病微血管并发症之一。DN早期无明显临床症状，但病情即可出现肾脏血流动力学异常，表现为肾小球高灌注和高滤过,肾血流量和肾小球滤过率(GFR)升高，且增加蛋白摄入后各指标升高程度更明显[1]。近年研究[2]表明，肠道菌群的改变与肥胖、DN的发生发展密切相关。终末期DN患者的肠道优势菌群比例失调，双歧杆菌属、乳酸杆菌属和粪杆菌属等益菌群数量明显减少，肠杆菌科细菌、肠球菌属细菌等有害菌群数量明显增多，导致患者血液炎症因子水平升高，有利于体内微炎症状态形成[3]。缬沙坦是一种血管紧张素Ⅱ(AT)受体拮抗剂，可降低肾小球对蛋白的通透性，延缓DN患者的肾功能衰竭[4]。但缬沙坦治疗DN的具体作用机制目前尚不明确。2016年1月～2017年6月，我们观察了缬沙坦灌胃的DN小鼠肠道菌群的变化，并分析其肠道菌群多样性，旨在为缬沙坦治疗DN的临床应用提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂及仪器 7只8周龄小鼠，雌雄不限，体质量(23.62±1.35)g; 14只周龄8周雄性DN模型(db/db)小鼠,体质量(30.28±1.47)g;购自南京模式动物研究所。缬沙坦分散片(山东益健药业有限公司)，葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，小鼠尿白蛋白(MAU)，ELISA检测试剂盒，小鼠尿素氮 (BUN)ELISA试剂盒酶标仪、制冰机、冷冻离心机、超净工作台、注射器(1 mL)、96孔酶标板、移液抢与枪头等。

1.2 动物分组及颉沙坦灌胃方法 将14只db/db小鼠随机分为A、B 两组，A组每天缬沙坦 50 mg/kg灌胃，B组等量生理盐水灌胃，另取7只正常小鼠为对照组，每天灌胃等量生理盐水。三组均灌胃8周。

1.3 各组小鼠肾功能指标观察 灌胃后取各组小鼠，测定体质量，尾部静脉取血，GOD-POD法测定血糖。收集各组小鼠24 h尿液，ELISA法检测小鼠尿素氮 (BUN)ELISA试剂盒酶标仪测定尿白蛋白和尿素氮，采用南京建成生物工程研究所尿白蛋白试剂盒，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 各组小鼠肠道菌群种属及其生物多样性分析 收集各组0.2 g粪便标本，采用QiaAmp Mini DNA-Isolation kit(德国Qiagen公司)提取细菌DNA，所有操作均严格按说明书进行。对提取细菌DNA进行高通量测序：以总DNA为模板，进行PCR扩增测序，引物序列为上游引物3′-GCCAGCAGCCGCGGTAA-5′；下游引物3′-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT-5′。测序结果分析：对细菌种属行PCoA分析，A、B组小鼠肠道菌群存在显著的分离效应，B组与对照组肠道菌群存在显著区别。进一步通过聚类分析将细菌进行分类,除db/db2，其余6个B组小鼠肠道菌群可聚为一类；除db/db-val6，其余6个A组小鼠肠道菌群可聚为一类。测算各组小鼠肠道细菌种属OTU指数。根据序列的相似性(本分析中阈值设定为97%)，将有效序列归为多个操作分类单元(OTU)，并将OTU中全部序列与相关数据库进行比对，找出与之最相近且可信度达80%以上的细菌种属信息，采用QIIME软件分析测序结果[5]。通过Chao1算法计算各组小鼠肠道菌群辛普森(Simpson)、香农(Shannon)指数，分析肠道菌群多样性。Shannon指数越大,生物多样性越高。Shannon指数描述种的个体出现紊乱和不确定性，不确定性越高说明生物多样性越高。纲、种属水平分析各组小鼠肠道菌群的相对丰度。

2 结果

灌胃后各组小鼠体质量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比较见表1。

表1 灌胃后各组小鼠体质量、血糖、尿白蛋白、尿素氮水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05;与B组比较，#P<0.05。

各组小鼠肠道菌群OTU指数、Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数比较见表2。

表2 各组小鼠肠道菌群OTU指数、Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数比较

注：与对照组比较，*P<0.05;与B组比较，#P<0.05。

纲水平上各组小鼠肠道菌群的相对丰度比较见表3。

表3 纲水平上各组小鼠肠道菌群相对丰度比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

种属水平上各组小鼠肠道菌群相对丰度比较见表4。

3 讨论

正常成人肠道内细菌总重量可达1～1.5 kg，其中益生菌为人体产生多种有益物质，帮助机体维持代谢平衡，从而保护人类健康[6]。肠道菌群定植于肠道中，通过其代谢产物，菌体蛋白及其活力影响着人体的代谢、免疫等多个方面，与疾病的发生息息相关[7]。很多因素例如抗生素、应激、辐射、肠蠕动改变及饮食变化等都可引起肠道菌群结构改变、细菌代谢活性变化或菌群在局部分布变化而引起的失衡状态[6]。在疾病的状态下，肠道菌群的多样性会发生改变。研究[8]表明，结直肠癌患者肠道菌群的多样性相对较低。肠道菌群失调在结直肠癌及结直肠腺瘤性息肉患者中表现出显著性差异[9]。厚壁菌门/拟杆菌门的比值增加与肥胖及糖尿病肾病的发生密切相关。糖尿病肾病患者肠道菌群结构中，双歧杆菌相对丰度降低，粪肠球菌相对丰度增加[10]。有研究[11]认为，新诊断T2DM患者肠道菌群结构中，梭状芽胞杆菌的丰度增加，并降低了拟杆菌的相对丰度。此外，通过检测T2DM患者血液中细菌16S rDNA水平，发现16S rDNA显著升高，该研究表明肠道菌群通过改变肠道通透性，参与了T2DM的发生、发展[12]。在肾病晚期患者中发现，双歧杆菌与嗜酸乳杆菌等有益菌数量减少、粪肠球菌等致病菌数量增加、炎症因子也增加，表明T2DM患者处于肾病晚期时肠道菌群比例失调，有益菌的减少和致病菌的增加导致体内炎症状态恶化，推动了2型糖尿病肾病的发展[13]。在本研究中，与对照组比较，B组小鼠肠道拟杆菌、疣微菌门丰度显著下降，硬壁菌门、无壁[细]菌类、脱铁杆菌门丰度上升；拟杆菌与硬壁菌门丰度降低。这些结果均表明，DN小鼠肠道细菌的菌群结构受到了严重影响。

表4 种属水平上各组小鼠肠道菌群相对丰度比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

药物及饮食干预可改变肠道菌群的结构，并达到治疗的效果。研究[14]表明，高脂饮食可显著降低小鼠肠道菌群的多样性，进食高纤维类食物可以增加肠道菌群的多样性。二甲双胍处理高脂饮食小鼠，可有效增加肠道中黏蛋白降解细菌AKKermansia Muciniphila菌相对丰度，改善糖耐受[17]。本研究中，A组小鼠尿白蛋白、尿素氮水平降低，推测缬沙坦具有保护糖尿病肾病小鼠肾脏的作用。进一步分析结果显示，与B组比较，A组OTU总数、Chao1指数、Simpson指数降低，Shannon指数升高，说明缬沙坦可显著影响糖尿病肾病小鼠肠道菌群多样性。与B组比较，纲水平上A组小鼠肠道菌群拟杆菌、疣微菌门丰度上升，壁菌门、无壁[细]菌类、脱铁杆菌门丰度下降。种属水平上A组小鼠肠道菌群大肠杆菌志贺菌、阿克曼菌丰度上升，Mucispirillum菌丰度下降。这些结果均表明，缬沙坦可能通过影响肠道菌群的结构，增加db/db小鼠的肠道菌群的多样性,达到保护糖尿病肾病小鼠肾脏的作用。

综上所述，缬沙坦灌胃的DN小鼠尿白蛋白、尿素氮均降低，缬沙坦灌胃的DN小鼠肠道菌群拟杆菌、疣微菌门、肠杆菌志贺菌和阿克曼菌丰度增加，硬壁菌门、无壁[细]菌类、脱铁杆菌门、Mucispirillum菌丰度降低。缬沙坦可能通过增加DN小鼠肠道菌群多样性、影响肠道菌群的结构，对DN小鼠肾脏起保护作用。