重组腺病毒Ad-TSHR289注射诱导Graves病小鼠模型

汤阳，朱晓云，冯慧，付守强，刘喜明

(中国中医科学院广安门医院，北京 10053)

Graves病(GD)是一种以甲状腺弥漫性肿大与功能亢进为特征的内分泌疾病[1]。血清T4、促甲状腺素受体抗体(TRAb)是目前临床常用的GD实验室指标。目前GD的发病机制尚未完全阐明，构建符合疾病特征的动物模型对研究GD的机制和治疗手段具有重要意义[2, 3]。模型是研究疾病机制的重要载体。内分泌疾病模型普遍造模时间长，导致研究效率低下。过表达人促甲状腺激素受体(TSHR)A亚单位的腺病毒(Ad-TSHR289)诱导的GD小鼠模型具有成模率高、重复性强等特点，向小鼠体内间断注射Ad-TSHR289腺病毒3次，造模第10周即可鉴定GD成模情况，是目前应用最为广泛的造模方法[4, 5]。本课题组前期采用多次注射5.62×107Pfu重组病毒量免疫BALB/c小鼠成功构建GD模型，造模时间接近3个月，严重影响研究效率。减少Ad-TSHR289免疫频次、提前鉴定是否影响GD成模？2018年3～7月，我们观察了2×109Pfu的Ad-TSHR289两次注射诱导GD模型效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、重组腺病毒、试剂及仪器 6～8周龄、体质量18～20 g的SPF级别BALB/c雌性小鼠36只购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国中医科学院广安门医院动物实验中心，编号为SYXK(京)2014-0041。小鼠适应性喂养1周，自由摄食摄水，明暗12 h/12 h，动物实验符合中国中医科学院广安门医院动物伦理标准。含人TSHR-A亚单位全长cDNA的质粒pSV2neoECE-TSHR289-6H-dhfr由美国加利福尼亚大学的Basil Rapoport教授惠赠；参照病毒制备方法[11]构建并优化，构建pAdCMV_TSHR289/Flag_mPGK_DsRedexpress2腺病毒表达载体(Ad-TSHR289)，质粒扩增、腺病毒构建、包装纯化、鉴定病毒转染力等均由北京东华纺生物有限公司进行。促甲状腺受体抗体检测试剂盒(Anti-TSHR，TRAb)购自美国罗氏；四碘甲状腺原氨酸试剂盒(T4)购自德国拜耳。倒置显微镜购自日本尼康；全自动化学发光免疫分析仪(ADVIA centaur CP)购自西门子，电化学发光全自动免疫分析系统(Cobas e 601)购自美国罗氏。

1.2 BALB/c小鼠小鼠分组及GD病小鼠模型造模 36只BALB/c小鼠，分为模型组(GD组)、正常对照组(NC组)，每组各18只。GD组分别于第1、4周小鼠胫前肌注射含2×109Pfu优化Ad-TSHR289腺病毒的PBS溶液；NC组分别于同时同部位注射等量PBS溶液。

2 结果

造模第7、13、18周两组小鼠血清T4、TRAb含量比较见表1。第7、13、18周GD组成模数分别为6、6、6。

表1 造模第7、13、18周两组小鼠血清T4、TRAb含量比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与本组第7周比较，#P<0.05。

在第7、13、18周可见，GD组小鼠甲状腺不同程度肿大、充血。HE染色后，NC组甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状，滤泡腔光滑，腔内充满均匀胶质。GD组甲状腺滤泡上皮细胞肥大，细胞呈高柱状，排列紧密，增生的细胞向滤泡腔内形成乳头状凸起，滤泡腔不光滑，腔内胶质明显减少、内含物增加，甲状腺组织内红细胞浸润明显，未观察到明显淋巴细胞浸润。随时间推移，甲状腺滤泡上皮细胞增生程度逐渐加重，滤泡腔逐渐变小。

3 讨论

GD是最常见的自身免疫性甲状腺疾病，世界范围内约有3%女性和0.5%男性是GD患者[1]。抗甲状腺药物、放射碘以及手术等是当前治疗GD的主要形式，但存在复发率高、造成甲状腺功能减退等并发症的缺陷。如何有效防治GD仍是学界难题。因此，探索符合GD临床特征与病理机制的动物模型是进一步研究本病的重要环节。目前认为甲状腺滤泡上皮细胞的TSHR受体被激活造成甲状腺的免疫失调是GD的关键发病机制。甲状腺功能亢进和甲状腺弥漫性肿大是GD关键特征[6]。重组腺病毒Ad-TSHR289构建的动物模型具备了良好的疾病特征，是当前研究GD的重要载体。但其造模时间长达3个月，一定程度上限制了本病的研究效率。本研究采用优化后的重组腺病毒2次免疫的方式构建GD动物模型从第7周起T4和TRAb的水平显著提高，甲状腺肿大明显并伴有甲状腺滤泡上皮细胞增生，从而证实该方法2次免疫即可于第7周成模，比以往3次免疫法10周成模缩短3周。

成模率是评价模型稳定性的核心指标。尽管重组腺病毒诱导的GD模型是当前应用最广泛的造模方法，但在2002年模型建立初期其成模率仅为50%～60%[4]。优化造模方法提高成模率成为研究方向。一方面，采用多种造模方式相结合的手段是一种较为成功的方法，如通过腺病毒免疫与电穿孔相结合的方式[7, 8]。近期研究发现，通过腺病毒免疫与电穿孔联合法构建的动物模型的成模率能达到80%以上，并伴有不同程度的GD眼病特征，成为了诸多学者探索的方向之一[9]。伍丽萍等[10]报道称通过3次免疫法，第10周检测成模率可达到75%。2013年我们首次应用Ad-TSHR289免疫法构建GD模型，第10周成模率可达70%[11]。2017年我们采用3次免疫法第10周检测小鼠成模情况，发现9/9达到成模指征[12]。因此，Ad-TSHR289免疫法构建的GD模型是具有稳定性强、成模率高等特点，是当前应用最为普遍的造模方式之一。而本研究显示，在第7、13、18周，GD组小鼠眼球血清T4、TRAb水平及甲状腺肿大特征均改变，符合GD临床特征，均达到成模标准。模型的维持时间是衡量模型成功性的另一个关键指标，需较高水平的TRAb的维持。外源性持续注入相关抗原是维持小鼠体内TRAb含量的关键途径，而多次有规律地重复免疫是延长模型特征时间的重要手段[2]。伍丽萍等[10]发现腺病毒免疫构建的模型最佳时期为第10周，可维持至第18周。Holthoff等[13]则在常规造模方法上进行改进，每3到4周的进行1次免疫，连续免疫9次，观察到模型维持时间，发现模型维持时间可达到9个月，是当前报道的本模型的最长维持时间。本研究发现，GD组T4含量在第7、13、18周均维持在较高水平，第13周时T4含量绝对值稍微降低，第18周回升，其可能与非同一批次检测造成的误差有关。TRAb水平第7周最高，至13周出现了明显降低，可能与减少了外源性的刺激相关；第18周较13周，TRAb水平虽然进一步降低，但并不显著。持续的外源性免疫刺激可能并非是维持GD小鼠体内TRAb含量相对衡定的唯一途径。调节性T细胞能够抑制T细胞与B细胞的活性从而维持机体免疫耐受[14]。GD是一类免疫耐受缺失导致的T细胞与B细胞主导型的自身免疫性疾病[15]，而B细胞又是刺激产生TRAb的重要因子[16]。因此，机体免疫失调后的内源性反应可能是产生TRAb的另一途径。但甲状腺组织病理并未见明显淋巴细胞浸润，内源性的TRAb途径仍需进一步验证。本研究发现，在第18周，模型组血清T4、TRAb保持在一个较高水平同时甲状腺肿大仍旧明显。本研究发现，本方法构建的GD模型具有以下体征：①成模时间早：通过2次免疫，于第1次免疫后第7周开始检测，发现其血清学指标与病理形态均有显著变化，即可判断成模；②成模率高：GD组全部小鼠血清中T4、TRAb在各个阶段均保持较高水平并伴有甲状腺肿大，进而推测成模率接近100%，但具体成模情况仍需大样本验证；③维持时间长：在第7周成模的基础上，进一步观察模型的维持情况，发现至第18周重组腺病毒免疫的小鼠GD特征仍明显，并且各项指标并无明显下降趋势。

减少免疫频次缩短成模时间，并未影响成模率与模型维持时间。病毒免疫量是影响模型成功率的重要因素。报道称注射高剂量的重组腺病毒能使T4更早处于较高水平，并维持更长时间[13]。早期利用Ad-TSHR289病毒构建GD模型单次所用剂量为5×107IU，模型在第10周为最佳水平，可维持至18周。因此，本研究中以2×109Pfu(约2.8×109IU)为单次注射量，在病毒注射总量上远远高于前者。重组腺病毒技术目前已更新至第三代，侵染力与结合力均更强[17]。

综上所述，2×109Pfu的Ad-TSHR289两次注射BALB/c小鼠第7周时即可成功构建GD模型，成模率和维持时间均较好。今后将进一步延长观察本模型的维持时间以及其他疾病特征(如甲状腺眼病等)，以期为研究GD提供一个高效、稳定的载体。