支气管哮喘患儿白介素1受体1基因RS1041973及RS10208293位点单核苷酸多态性观察

徐哲,刘亚军, 鄢程程,丁艺,何婷婷,张福,高清川

(广元市中心医院，四川广元628000)

据统计，全球的儿童哮喘发病率逐年上升[1]。根据2014年全球哮喘防治创议委员会调查研究表明[2]，≤5岁儿童哮喘的病因复杂，其发病的病理生理学机制亦尚未彻底清楚，可能与内分泌因素、神经、免疫精神和遗传学背景等密切相关。目前的观点[3]是遗传和环境因素相互作用共同导致哮喘的发展和演变。国外早期的全基因组关联研究(GWAS)[4]已确定多个染色体位点与哮喘相关，且多项关于候选基因变异与哮喘风险的相关性研究[5]提出了多种易感基因。最新GWAS研究[6]发现，白介素1受体1(Interleukin 1 receptor-like 1, IL1RL1)基因是哮喘的易感基因。进一步研究[7]发现，汉族哮喘患者血清L1RL1水平升高，且该易感基因的RS1558641位点与过敏性哮喘发生发展有关。我们前期基于Hapmap数据库(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的IL1RL1基因组遗传变异资料，采用Haploview软件确定其多态位点的分布频率，利用Tagger功能，按照在中国人群中最下等位基因频率>5%，并且与区段内其他单核苷酸多态性(SNP)的连锁不平衡系数均>0.8的原则，最终筛选出RS1041973、RS1020893位点可能与过敏性哮喘有关。但婴幼儿哮喘与IL1RL1基因中RS1041973、RS1020893位点的相关性研究较少。我们观察了支气管哮喘患儿IL1RL1基因RS1041973、RS1020893位点的SNP，旨在为婴幼儿支气管哮喘的病理生理学机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2012年1月～2015年1月在广元市中心医院儿科门诊及住院确诊为支气管哮喘[8]的患儿86例为哮喘组，其中男49 例，女37例，年龄5月～3(1.49 ± 0.70) 岁。同时随机选取同时体检的健康儿童100例为对照组，其中男50例，女50例，年龄 3 月～3 (1.52 ± 0.85)岁。两组年龄、性别比例具有可比性。两组纳入对象均排除既往有心肺、肝病或肾病疾患，过敏性疾患及其他变态反应性疾患史，免疫性疾病史和慢性疾病史，近四周无感染及服药史。本研究通过广元市中心医院伦理委员会审核批准，纳入患儿家长均签署知情同意书。

1.2 两组IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位点基因型及等位基因分析方法 抽取两组空腹静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min。采用天根血液DNA提取试剂盒(DP348)，参照试剂盒说明书，提取血液DNA，-70 ℃保存备用。利用探针、引物找到其IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位点并对其进行扩增，采用ARMS-qPCR法对其基因位点行基因分型检测。设计引物、探针及利用Primer Premer6软件设计扩增引物由上海捷瑞生物公司合成，所有引物及探针可见表1、2。

表1 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位点基本信息、引物及探针序列

表2 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位点测序引物序列

荧光定量PCR结合特异性ARMS引物和探针，检测IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位点的基因型以及等位基因的表达情况。荧光定量PCR 反应条件为:95 ℃ 3 min， 40个循环：94℃ 10 s，60 ℃ 40 s。RS1041973 位点A/C基因型测序结果包括AA、AC、CC三种基因型，RS10208293位点A/G基因型测序结果包括AA、AG、GG三个基因型。

1.3 两组血清IL1RL1、IgE检测 采用ELISA法。抽取两组空腹静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，取血清。人血IL1RL1定量免疫试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，参照其试剂盒说明检测两组血清IL1RL1。人IgE定量免疫试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，参照其试剂盒说明检测两组血清IgE。

2 结果

哮喘组IL1RL1基因RS1041973位点基因型AA、AC、CC的分布频率分别为3.5%(3/86)、23.3%(20/86)、73.2%(63/86)，等位基因A、C的分布频率分别为15.2%(26/172)、84.8%(146/172)；对照组分别为8.0%(8/100)、26.0%(26/100)、66.0%(66/100)、21%(42/200)、79%(158/200)；两组AC、CC基因型分布频率及等位基因A、C的分布频率差异存在统计学意义(P均<0.05)。与RS1041973位点基因型AA基因人群比较，RS1041973位点AC、CC基因型的个体患哮喘的风险性增加(校正OR=1.769，2.212；95%CI：0.47～6.655，0.637～7.687)；且携带C等位基因的个体患哮喘的危险度是A基因的1.506倍(95%CI：0.726～3.126，P<0.05)。

哮喘组IL1RL1基因RS10208293位点基因型AA、AG、GG的分布频率分别为4.6%(4/86)、25.6%(22/86)、69.8%(60/86)，等位基因A、G的分布频率分别为17.4%(30/172)、82.6%(142/172)；对照组分别为7.0%(7/100)、29.0%(29/100)、64.0%(64/100)、21.5%(43/200)、78.5%(157/200)；两组AG、GG基因型分布频率及等位基因A、G的分布频率差异存在统计学意义(P均<0.05)。与RS10208293位点基因型AA基因人群比较，RS10208293位点AG、GG基因型的个体患哮喘的风险性增加(校正OR=1.255，1.531；95%CI：0.355～-4.442，0.463～ 5.067)；且携带G等位基因的个体患哮喘的危险度是A基因的1.36倍(95%CI：0.673～2.749，P<0.05)。

哮喘组、对照组血清IL1R1分别为(78.32±53.32)、(67.36 ±36.73)ng/mL(P<0.05)；哮喘组、对照组血清IgE分别为(140.87±65.32)、(87.84±45.22)ng/mL(P<0.05)。

3 讨论

炎症免疫反应在支气管哮喘发病中的作用机制一直是备受关注的焦点。研究[9]发现,Th2细胞在支气管哮喘的炎症反应过程中发挥了及其重要的作用。IL1RL1基因定位于2号染色体上，最早从BALB/c-3T3细胞系中得到IL1RL1基因，其结构与IL-1受体(IL-1R)相似，具有 Toll/IL-1R的结构域，同时主要表达于肺动脉内皮细胞、支气管上皮细胞、肥大细胞、T淋巴细胞和TH2细胞。以往研究[10]证实在不同人群中 IL1RL1 基因与哮喘的发病风险相关。

IL1RL1 基因编码位于 TH2 细胞和调节性T 细胞受体。IL1RL1可特异性识别并结合IL-33，两者相互作用，借助IL-1 辅助受体蛋白( IL-1RAcP)而形成IL-33/ IL1RL1复合物[11]。胞膜上IL1RL1和 IL-1RAcP 可组合形成异二聚体，通过与IL-33 结合，将信号转导至胞内并激活下游丝裂原活化蛋白激酶( MAPKK) ，导致 NF-κB 从复合物中释放出来，最终激活Th2 细胞因子，促Th2细胞因子过表达，启动炎症反应的发生[13]。本研究结果发现，在支气管哮喘患儿中IL-33的过表达和IL1RL1过表达同时存在，进一步证实了IL-33/ IL1RL1复合物激活的信号通路在哮喘中具有举足轻重的作用。IL-33/IL1RL1通路多态性与哮喘表型相关联。以上研究结果均提示，阻断IL-33/IL1RL1 信号通路可减少TH2细胞因子的激活，减轻炎症反应以达到治疗哮喘的效果。

支气管哮喘是一种气道慢性炎症，TH2细胞因子的活化是其病理生理学基础[13]，IL-33/ IL1RL1复合物可以将信号转导至胞内激活MAPKK，导致NF-κB的释放，激活Th2 细胞因子，促进Th2细胞因子过表达，从而导致Th2高表达，Th2高表达型通常表现为血清IgE的增高[14]，从而导致炎症反应的发生。本研究发现，哮喘组血清IL1RL1和IgE的水平明显高于对照组，提示IL1RL1表达与血清IgE表达可能具有一定的关系。

RS1041973 位点位于IL1RL1基因的三号外显子上，为非同义突变，其突变可导致细胞膜外部区域的IL1RL1蛋白特定位点的谷氨酸突变为丙氨酸，其结果是使负电荷的氨基酸突变为中性氨基酸，从而导致在细胞外免疫球蛋白样结构域的构象改变[15]。RS1041973位点A>C,在哮喘患儿中分布增多，且IL1RL1蛋白的血清含量明显增多，同样也说明该位点的突变可能与IL1RL1基因的过表达相关，过度激活IL-33/ IL1RL1信号通路，导致呼吸道的过敏反应，进而引发婴幼儿的哮喘发作。RS10208293位点位于IL1RL1基因的内含子区域，实验研究发现该位点的A>G,也与IL1RL1表达量增高相关，推测可能的原因为该位点与调节该基因转录翻译的位点存在连锁效应，但进一步的分子机制有待研究。

本研究结果发现，与对照组比较，哮喘组IL1RL1基因RS1041973位点基因型AC、CC的分布频率高。RS1041973的基因型位点中的AA、AC、CC这三种基因型，AA基因型不增加哮喘发生危险，AA基因型的OR值为1，而AC、CC基因型均可增加哮喘发生的危险性，在RS1041973的等位基因型A和C中，A等位基因不能使哮喘的患病风险增高，A等位基因的OR值为1，而C等位基因可能提示患病风险增高，说明与RS1041973位点基因型AA基因人群比较，RS1041973位点AC、CC基因型的个体患哮喘的风险性增加；且携带C等位基因的个体患哮喘的危险度是A基因的1.506倍。与对照组比较，哮喘组IL1RL1基因RS1041973位点基因型AG、GG的分布频率高。在RS102082933的基因型位点中的AA、AG、GG这三种基因型，AA基因型不能增加哮喘发生的危险性，AA基因型的OR值为1，而 AG 和GG 基因型均能增加哮喘发生的危险性，RS102082933位点等位基因型A和G中，A等位基因不能使哮喘的患病风险增高，A等位基因的OR值为1，而G等位基因可能提示患病风险增高，提示与RS10208293位点基因型AA基因人群比较，RS10208293位点AG、GG基因型的个体患哮喘的风险性增加；且携带G等位基因的个体患哮喘的危险度是A基因的1.36倍。

综上所述，支气管哮喘患儿IL1RL1基因RS1041973位点基因型AC、CC的分布频率高，C等位基因突变频率高；RS10208293位点基因型AG、GG的分布频率高，G等位基因突变频率较高。IL1RL1基因RS1041973位点A/C的C等位基因、RS10208293位点A/G的G等位基因可能与支气管哮喘的易感性有关。支气管哮喘患儿血清IL1RL1、IgE均水平增高，IL1RL1、IgE可能通过过度激活TH2细胞因子，在支气管哮喘的发生发展中发挥重要作用。