人软骨肉瘤中miR-140-5p靶基因预测验证及对靶基因表达的调控作用观察

李竟源，许凯，刘时璋，刘宗智，易智，杜青芳，王坤正，李建辉，祖超

(1西北工业大学附属陕西省人民医院，西安710068；2 华中科技大学同济医院;3西安交通大学第二附属医院)

软骨肉瘤是一类源自软骨细胞的恶性病变,其发病率约占原发性恶性骨肿瘤的40%,仅次于骨肉瘤[1,2]。软骨肉瘤的早期临床症状和体征并不典型，多数患者发现时病情已进展为晚期。传统型软骨肉瘤基质丰富且血运匮乏，化疗和放疗对其效果并不敏感，广泛切除肿瘤是当前的主要治疗方法[3]。软骨肉瘤易出现局部侵袭和远处转移，且术后易复发，因此预后欠佳。寻找新的软骨肉瘤生物标志物，探寻更有效的软骨肉瘤治疗方法是目前的研究热点。MicroRNA(miRNA)一类无编码特性的内源性小分子RNA，在维持细胞周期的发生、发展、凋亡方面起着重要作用[4]。研究[5，6]发现，多种miRNA与软骨肉瘤的发生、发展有关。miRNA可与其靶基因mRNA 3′端非翻译区(3′UTR)碱基互补配对，并根据互补程度不同抑制靶基因的翻译或促进其降解，实现对靶基因的转录后表达调控[7]。葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)是介导细胞葡萄糖摄取的主要载体, 广泛存在于人体各组织、细胞中, 与代谢密切相关。近年研究[8]发现，肝癌、肺癌等肿瘤细胞中GLUT-1 均高表达，GLUT-1 可大量摄入葡萄糖维持肿瘤细胞的生长与增殖。我们前期研究发现，人软骨肉瘤组织及人软骨肉瘤细胞系JJ012中miR-140-5p的表达均降低；上调miR-140-5p可显著抑制人软骨肉瘤细胞系JJ012的迁移、侵袭、增殖和生长。但 miR-140-5p是否通过调控GLUT-1在人软骨肉瘤中的发生发展中发挥重要作用 目前鲜有报道阐明miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因及其交互作用机制。2018年2月～2018年9月，我们利用miRNA靶基因预测软件,分析miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因，并进一步观察转染miR-140-5p的人软骨瘤细胞株靶基因mRNA及蛋白的表达变化。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人软骨肉瘤细胞系JJ012及人胚肾细胞HEK 293T。JJ012来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，HEK 293T来自Clontech公司。dsDNA oligo(吉凯, 中国)、PCR试剂Primer (吉凯，中国)、PGEM-T EASY载体(Promega, 美国)、双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega, 美国)、Taq聚合酶(Takara, 日本)、质粒大抽试剂盒(天根, 中国)、质粒小抽试剂盒(Qiagen, 德国)、BSA(捷倍思, 中国)、PmirGLO载体(Promega, 美国)、感受态大肠杆菌DH5α(Takara, 美国)、X-gal、IPTG、氨苄青霉素(Simga, 美国)等。

1.2 miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因预测 通过microRNA.org、NCBI GenBank软件预测miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因。microRNA.org软件检索miR-140-5p序列，miRBase、miRWalk靶基因预测分析数据库预测预测miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因，通过NCBI GenBank检索靶基因3′UTR序列。miR-140-5p可靶向结合GLUT-1的3′UTR区的一个位点(图1)，认为GLUT-1可能为miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因。

图1 miR-140-5p与GLUT-1 3′UTR区的靶位点

1.3 miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因鉴定 将GLUT-1 3′UTR序列和萤火虫荧光素酶基因连接并插入到PmirGLO 双荧光素酶表达载体，对照荧光素酶活性检测系统选择海肾荧光素酶基因载体PRL-SV40，然后做归一化分析，构建野生型(WT，正常表达)GLUT-1 3′UTR双荧光素酶报告载体。利用点突变试剂盒构建突变型(MUT，抑制表达)GLUT-1 3′UTR双荧光素酶报告载体。序列验证由测序公司完成。将HEK 293T细胞分为A、B组，分别转染miR-140-5p mimics(促进miR-140-5p表达)+WT型GLUT-1 3′UTR荧光素报告载体、miR-140-5p mimics+MUT型GLUT-1 3′UTR荧光素报告载体，，利用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光值，测算萤火虫荧光素酶相对活性。萤火虫荧光素酶相对活性可说明靶基因3′UTR区是否与miR-140-5p mimics产生靶向作用，以及对荧光素酶活性的影响(图1)。萤火虫荧光素酶相对活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。实验重复3次，取平均值。

1.4 转染miR-140-5p的JJ012细胞GLUT-1 mRNA及蛋白检测

1.4.1 JJ012细胞分组及miR-140-5p mimics转染 取对数生长期JJ012细胞，接种于6 孔板中，常规条件下培养，细胞融合度60%～70%时进行细胞转染。将JJ012细胞分为观察组、对照组，分别转染miR-140-5p mimics、NC mimics(空白无意义)，严格按Lipofectamine TM2000说明书操作，转染24 h时qRT-PCR法检测两组miR-140-5p，观察组、对照组细胞miR-140-5p的相对表达量分别为14.62±1.53、1.02±0.05，二者比较，P<0.05，表明miR-140-5p 转染效率高。

1.4.2 JJ012细胞GLUT-1 mRNA检测 转染48 h时采用qRT-PCR法检测两组GLUT-1 mRNA。按照TRIzol试剂说明书提取JJ012细胞总RNA，鉴定纯度和含量后，反转录合成cDNA。cDNA合成参照反转录试剂盒说明书操作。以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系进行PCR反应。反应条件：94 ℃ 2 min；40个循环(94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s)；GLUT-1基因PCR反应条件：94 ℃ 2 min；40个循环(94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)。miR-140-5p以U6作为内参基因，GLUT-1以GAPDH作为内参基因，以2-△△Ct代表目的基因的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4.3 JJ012细胞GLUT-1蛋白检测 采用Western blotting法。 取对数生长期两组细胞，常规提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白浓度。每个样本取200 μL样品，蛋白经10% SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜，5%封闭液4 ℃封闭4 h，TBS缓冲液漂洗3遍，加入GLUT-1和GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜，TBS缓冲液漂洗3遍，加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，ECL显影液显影，Quality One软件分析条带灰度，以GLUT-1与GAPDH灰度的比值表示GLUT-1蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件(SPSS Inc. Chicago)进行处理。计量资料以χ2表示，组间比较采用Student′s实验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

WT、MUT型GLUT-1 3′UTR区域序列见图1。A、B组荧光素酶活性分别为0.37±0.03、0.93±0.01，二者比较，P<0.05。

图1 野生型和突变型GLUT-1 3′UTR区域序列构建双荧光素酶报告载体

观察组、对照组细胞GLUT-1 mRNA的相对表达量分别为0.31±0.10、0.95±0.06，二者比较，P<0.05。

观察组、对照组细胞GLUT-1的蛋白相对表达量分别为0.42±0.13、 0.93±0.07，二者比较，P<0.05。

3 讨论

与尤文肉瘤和骨肉瘤不同的是，大多数软骨肉瘤术后的患者往往因为远处转移而导致预后很差[9]。因此，寻找新颖的诊断标记物和治疗靶点十分必要。miRNA一类长度约23个核苷酸的非编码RNA，其在细胞中起到重要的调控功能，主要作为转录后的调控因子维持细胞的生长和凋亡[10]。大量文献[11]表明miRNA在肿瘤的发生发展过程中起到至关重要的作用。miRNA最常见的作用方式是通过结合其靶基因的3′UTR区，对其靶基因的表达进行沉默，具体又分为直接对靶基因的mRNA进行切割，或者干扰靶基因mRNA的进一步翻译[12,13]。

我们的前期研究发现，miR-140-5p在人软骨肉瘤细胞系JJ012和人软骨内瘤组织中均呈低表达，外源性上调miR-140-5p可显著抑制软骨肉瘤的迁移和侵袭能力。本研究中，我们运用生物信息学软件microRNA.org、miRBase、miRWalk预测了miR-140-5p的靶基因，发现GLUT-1可能是miR-140-5p的靶基因。为了验证miR-140-5p与GLUT-1之间的关系，我们建立双荧光素酶报告系统，对此设想进行验证。我们利用含有GLUT-1 3′UTR区的野生型WT和突变型MUT质粒PmirGLO载体，经基因测序后序列完全正确。将WT组、MUT组分别和miR-140-5p、阴性对照质粒共转染HEK 293T细胞，结果显示过表达miR-140-5p可显著压低野生型WT 3′UTR报告载体的荧光素酶活性，但是基本不改变突变型MUT 3′UTR报告载体的荧光素酶活性。提示miR-140-5p可靶向结合GLUT-1野生型WT 3′UTR区，并形成RISC沉默复合物，导致荧光素酶基因翻译量减少，荧光素活性减低。以上结果表明miR-140-5p对GLUT-1的报告基因质粒荧光素酶活性的调节是通过与GLUT-1的3′UTR端的序列互补结合来实现的，因此说明GLUT-1是miR-140-5p在人软骨肉瘤中的直接靶基因。

多种因子参与对肿瘤能量代谢的调控，其中尤以GLUT-1的作用最为关键。研究[8]发现，GLUT-1不仅能够调控肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，维持葡萄糖的基础代谢，同时GLUT-1还在多种肿瘤中异常表达，以满足肿瘤细胞快速生长对能量的需求。我们的前期研究结合这些研究均表明，GLUT-1对维持软骨肉瘤细胞的生长、分化、转移及预后发挥关键的调控作用，但GLUT-1是否参与了软骨肉瘤的发病机制，miR-140-5p及GLUT-1是否与软骨肉瘤患者的临床病理特征相关，是值得我们进一步研究的热点。

本研究结果发现，外源性过表达miR-140-5p可以明显降低人软骨肉瘤细胞JJ012内源性GLUT-1的mRNA及蛋白的表达水平，结合上述的双荧光素酶报告系统，更加确定了miR-140-5p通过靶向作用于GLUT-13′UTR区来调控人软骨肉瘤细胞迁移、侵袭、增殖和生长等肿瘤细胞恶性表型。同时，也说明miR-140-5p在软骨肉瘤中抑癌miRNA的角色也是通过抑制转录调控致癌基因GLUT-1的表达实现的。

综上所述，miR-140-5p在人软骨肉瘤中的靶基因可能为GLUT-1。miR-140-5p主要通过靶向结合GLUT-1 3′UTR区域进行mRNA转录后调控。miR-140-5p主要通过直接靶向作用于GLUT-1 3′UTR进而抑制蛋白翻译过程。